cours 9 mcb2399 Flashcards
quels sont les différents types d’analyse pour quantifier expression génique
par gène:
- gène rapporteur
- northern, RT, RT-PCR, qRT-PCR
par analyse gloable
- biopuce (microarray)
- durant infection: SCOTS
- RNA-seq
à partir de quoi mesure-t-on l’expression génique
- niveau ARN
- protéines
pourquoi utiliser un gène rapporteur
pcq facilement détectable par colorimétrie, luminescence, fluorescence
quelles sont les deux manières d’utiliser un gène rapporteur
- expression du gène et amplification de la région promotrice pour ensuite l’insérer dans plasmide contenant gène rapporteur
- à partir ADN génomique: digestion et insertion: chaque plasmide aura un fragment ADN permettant identifier gènes exprimés en même temps
(+/- compris la partie ADN génomique)
comment mesurer le gène lacZ
par beta-galactosidase qui dégrade substrats (ONPG, X-Gal)
1. prend DO WT
2. lyse cellules
3. ajoujt substrat
4. incubation
5. arrêt quand devient coloré (ONPG jaune)
6. prend DO
7. calculs unités Miller
qu’est-ce qui est utilisé comme gène rapporteur pour la luminescence
luciférase
- aucune perturbation de la cellule
quel est l’utilité du gène rapporteur
- déterminer niveau expression
- déterminer condition qui permettent expression maximale
- déterminer localisation
qu’est-ce que la transcriptome
ensemble de ARN
analyses transcriptomiques: pour caractériser, comparer, quantifier transcription
quelles sont les méhtodes d’analyse du transcriptome
mesure niveau de tous ARN résultant de transcription
- biopuce
- RNA-seq
quels sont les avantages/désavantages des biopuces
+ : détermine et compare expression tous les gènes en même temps,
- : ARN courte vie, dégrade vite, besoin bcp matériel, interprétation
type de biopuces: ORF et oligonucléotides
comment fonctionne la biopuce ORF
- dépose ORF sur lamelle à des points spécifique
- RT pour ARN de différentes souches
- ADNc lié à une sonde de couleur spécifique
- se lie/ou non aux ORF
- différents points de couleurs
avantage biopuce oligonucléotide
fait chevauchemement: permis de connaître d’autres ARN régulateurs qui étaient situés dans régions intergéniques
(avec ORF: ne voit pas ça, voit juste séquence codante)
quelles sont les classes d’abondances de ARNm
- forte (95% des ARNm)
- medium
- faible
comment déterminer les ARNm bactériens présents lors d’une infection de macrophages
avec SCOTS:
ARN RT en ADNc
ADN bactérine biotinylé et bloqué avec ARNr
fait réagit les deux ensemble: ADNc va s’hybrider a ADNg
fait plusieurs cycles pour permettres aux différents “ARNm” de se lier même ceux de faible abondance
biotinylé pour lier avec bille de streptavidine?
combien de rondes de SCOTS nécessaire
3 pcq après atteint plateau
applications de SCOTS
- identification gènes appropriés
- applicable à tous microorganismes
- pas besoin de librairie, etc
- détection expression à partir de peu de bactéries
comment fonctionne RNA-seq
ARNm qu’on fragmente
mets ensuite avec génome de référence pour voir où se trouve les gènes
(exemples gènes bactérie infection in vitro vs in vivo)
comment se font les vaccin à ARNm
- clonage dans un plasmide
- coupe ADN
- formation ARNm
- insert dans nanoparticule lipidique pour protéger ARNm
