cours 9 mcb2399

Question 1

quels sont les différents types d’analyse pour quantifier expression génique

Answer 1

par gène:
- gène rapporteur
- northern, RT, RT-PCR, qRT-PCR
par analyse gloable
- biopuce (microarray)
- durant infection: SCOTS
- RNA-seq

Question 2

à partir de quoi mesure-t-on l’expression génique

Answer 2

• niveau ARN
• protéines

Question 3

pourquoi utiliser un gène rapporteur

Answer 3

pcq facilement détectable par colorimétrie, luminescence, fluorescence

Question 4

quelles sont les deux manières d’utiliser un gène rapporteur

Answer 4

• expression du gène et amplification de la région promotrice pour ensuite l’insérer dans plasmide contenant gène rapporteur
• à partir ADN génomique: digestion et insertion: chaque plasmide aura un fragment ADN permettant identifier gènes exprimés en même temps

(+/- compris la partie ADN génomique)

Question 5

comment mesurer le gène lacZ

Answer 5

par beta-galactosidase qui dégrade substrats (ONPG, X-Gal)
1. prend DO WT
2. lyse cellules
3. ajoujt substrat
4. incubation
5. arrêt quand devient coloré (ONPG jaune)
6. prend DO
7. calculs unités Miller

Question 6

qu’est-ce qui est utilisé comme gène rapporteur pour la luminescence

Answer 6

luciférase
- aucune perturbation de la cellule

Question 7

quel est l’utilité du gène rapporteur

Answer 7

• déterminer niveau expression
• déterminer condition qui permettent expression maximale
• déterminer localisation

Question 8

qu’est-ce que la transcriptome

Answer 8

ensemble de ARN
analyses transcriptomiques: pour caractériser, comparer, quantifier transcription

Question 9

quelles sont les méhtodes d’analyse du transcriptome

Answer 9

mesure niveau de tous ARN résultant de transcription
- biopuce
- RNA-seq

Question 10

quels sont les avantages/désavantages des biopuces

Answer 10

+ : détermine et compare expression tous les gènes en même temps,
- : ARN courte vie, dégrade vite, besoin bcp matériel, interprétation

type de biopuces: ORF et oligonucléotides

Question 11

comment fonctionne la biopuce ORF

Answer 11

1. dépose ORF sur lamelle à des points spécifique
2. RT pour ARN de différentes souches
3. ADNc lié à une sonde de couleur spécifique
4. se lie/ou non aux ORF
5. différents points de couleurs

Question 12

avantage biopuce oligonucléotide

Answer 12

fait chevauchemement: permis de connaître d’autres ARN régulateurs qui étaient situés dans régions intergéniques

(avec ORF: ne voit pas ça, voit juste séquence codante)

Question 13

quelles sont les classes d’abondances de ARNm

Answer 13

• forte (95% des ARNm)
• medium
• faible

Question 13

comment déterminer les ARNm bactériens présents lors d’une infection de macrophages

Answer 13

avec SCOTS:
ARN RT en ADNc
ADN bactérine biotinylé et bloqué avec ARNr
fait réagit les deux ensemble: ADNc va s’hybrider a ADNg
fait plusieurs cycles pour permettres aux différents “ARNm” de se lier même ceux de faible abondance

biotinylé pour lier avec bille de streptavidine?

Question 14

combien de rondes de SCOTS nécessaire

Answer 14

3 pcq après atteint plateau

Question 15

applications de SCOTS

Answer 15

• identification gènes appropriés
• applicable à tous microorganismes
• pas besoin de librairie, etc
• détection expression à partir de peu de bactéries

Question 16

comment fonctionne RNA-seq

Answer 16

ARNm qu’on fragmente
mets ensuite avec génome de référence pour voir où se trouve les gènes
(exemples gènes bactérie infection in vitro vs in vivo)

Question 17

comment se font les vaccin à ARNm

Answer 17

• clonage dans un plasmide
• coupe ADN
• formation ARNm
• insert dans nanoparticule lipidique pour protéger ARNm