cours 11 mcb2399 Flashcards
comment augmenter la production de protéines
- augmenter copies ADN
- augmenter ARN
- augmenter traduction
en quoi consiste le design des purification
isolation à partir des tissus/cellules
production dans un système d’expression: bactérie, levure, cellule mammifère, plante, cellule insecte, in vitro
quels sont les avantages/désavantages de l’expression protéique in vitro
+ : pas besoin de clonage, rapide, plusieurs expressions simultanément, production protéines difficiles ou toxiques
- : cout, faible quantité matériel, ADNc pour protéines eucaryote
en quoi consiste l’expression protéique in vitro
- ajout ADN/ARN pol
- ribosomes
- incubation
- synthèse protéine
- purification
en quoi consiste l’expression protéique utilisant les bactéries
avec des vecteurs:
- promoteur fort
- codons optimisés
- signaux traduction optimisés
- tag affinité pour faciliter purification (his-tag)
- fusion à protéines bactériennes
- épitopes reconnus par Ac
caractéristiques du plasmide pGEX pour expression protéique chez E.coli
- partie N-terminale GST
- site protéases
- besoin de cloner dans bon cadre de lecture
- promoteur inductible à IPTG (possède lac-)
principe de purification des protéines
(globale)
- lyse cellulaire
- centrifugation
- précipitation a.n
- précipitation protéines
- chromatographie
- obtention protéine pure
quels sont les procédés de séparation de protéines
- précipitation
- chromatographie
- électrophorèse
- centrifugation
- ultrafiltration
comment faire la lyse bactérienne
- produits chimiques
- conditions alcalines
- traitement enzymatique
- traitement physique
quels produits chimiques utilisés pour la lyse bactérienne et quel est l’avantage des produits chimiques
- détergent
- antibio
- solvants
- agent dénaturant
moins de chance de dégradation
quels sont les traitements physiques utilisés pour la lyse bactérienne et quels sont leur désavantage
- sonication
- homogénisation
- agitation avec abrasifs
- gel-dégel
possibilité de dénaturer
pourquoi faire des précipitations pour purifier protéines
- éliminer bonne partie des protéines non désirées
comment se fait la précipitation avec le sulfate ammonium
salting-out:
bcp sel: provoque agrégation des protéines= précipitation
ions kosmotrope vs chaotrope
kosmotrope: sulfate d’ammonium: augmentation concentration permet précipitation stable
ions kosmotropique = ion stabilisant
chaotrope: urée: augmentation concentration cause dénaturation
ion chaotropique = ion dénaturant
à quoi peut servir la dialyse
changer composition des solutions:
solution dans membrane semi-perméable: permet échange ions mais pas protéines
comment fonctionne l’ultrafiltration
comme dialyse en utilisant centrifugeuse pour faire traverser tampon à travers un filtre
la charge des protéines dépend de quoi
séquence a.a (point isoélectrique)
pH solution
en chromatographie qu’est-ce que le flow through
ce qui n’interagit pas avec résine
différence entre gradient linéaire vs en étape en chromatographie
linéaire: plus de pics
étape: plus plus larges
comment fonctionne la chromatographie d’exclusion/filtration sur gel
selon taille: si trop gros: va pas lier pores donc va éluer plus vite
caractéristiques de la chromatographie aux interactions hydrophobes
- 8 a.a hydrophobes
- souvent caché à intérieur protéine
- résine possède groupements hydrophobes lié au gel agarose
- utilisation gradient décroissant
comment fonctionne la purification des protéines his-tag par chromatographie d’affinité
- tag protéines avec his
- résine: nickel
- nickel et his interagissent
- élution avec imidazole qui compétitionne avec his
quels types de résine peut-on utiliser en chromatographie d’affinité
- Ni-NTA (protéine his-tag)
- amylose (protéine MBP)
- glutathione (protéine GST)
- chitine
- anticorps spécifiques
comment mesurer l’activité proétique par unité d’activité d’une protéine
quantité substrat converti en produit final selon le temps et avec des conditions pré-établies
ex: µmol de produit/min
comment peut-on mesurer la quantité de protéines
-Bradford essay (chimique, lecture spectro)
- absorbance à 280 nm (en temps réel, mais moins précis)
- fluorescence
caractéristiques SDS-PAGE
- conditions dénaturantes: pour linéariser protéines
- coloration après électrophorèse
quelles sont les 2 dimensions de SDS-PAGE 2D
horizontal: pI
vertical: par taille
caractéristique immunoblot/ westernblot
- détection protéine spécifique avec anticorps
- quantitatif
- détection colori/fluométrique, chimiolumiscence, radioactivité
étapes immunoblot avec luminol
- séparation SDS-PAGE
- transfert sur membrane
- blocage région non-spécifiques
- incubation Ac primaire
- incubation Ac secondaire lié HRP
- HRP + peroxydase: H2O et O2 -> oxydation luminol -> produit lumière -> détection
comment stabiliser les protéines pendant et après purification
- solution maintien pH
- baisse T et conservation au froid
- travailler quick
- inhiber protéases
- agents stabilisant: glycérol et BSA
qquels sont les 2 types de bio-interactions
- protéine-protéine
- protéine- a.n.
quelles sont les méthodes d’analyses des bio-interactions protéine-protéine
in vivo:
- 2 hybrides
- FRET
in vitro:
- immunoprécipitation
- FRET
- phage display
en quoi consiste la méthode 2 hybrides pour les bio-interactions
fusionne 2 protéines à étudier aux 2 domaines GAL4 (DBD et AD)
domaines de GAL4: un activateur et un lie ADN: besoin de fusionner les 2 domaines pour transcription gène rapporteur
quels sont les avantages/inconvénients de la méthode 2 hybrides pour les bio-interactions
+: in vivo, quantifiable, faible cout
-: faux négatifs/positifs, besoin clonage pour fusion traductionnelle
comment fonctionne la méthode FRET pour les bio-interactions
protéines fluorescentes: si les 2 sont proches: émission de lumière
activation protéine 1: émission lumière qui active protéine 2 qui émet une autre lumière
FRET se fait in vivo ou in vitro
les deux
en quoi consiste la méthode pull-down/immunoprécipitation pour les bio-interactions
- si 2 protéines réagissent ensemble: si on purifie 1 l’autre devrait suivre
- purifie par chromato classique ou affinité, avec billes magnétiques
- visualisation par SDS-PAGE
- utilisation tag
comment fonctionne la méthode phage display pour les bio-interactions
- peptides spécifiques qui lie capside de phages sont liés à plaque
- ajout de plusieurs phages: dont 1 devrait lier
- élution de ce phage puis séquençage
quelles sont les méthodes de détections pour les bio-interactions protéines-ADN
in vivo:
- ChIP
in vitro:
- retard sur gel (EMSA)
- empreinte sur ADN
comment fonctionne la méthode EMSA pour bio-interactions
quand protéine lie une autre: va avoir un retard sur le gel vs protéine qui n’a pas liée
peut utiliser supershift: exemple Ac pour un 2e degré de retard sur gel
comment fonctionne empreinte sur ADN/footprinting pour les bio-interactions
- fragments sont clivés sauf en endroits ou protéine protège contre clivage
- va former en trou sur gel où aurait du être la séquence
comment fonctionne la méthode ChIP pour bio-interactions
- fixation ADN-protéine: complex stable
- purification ADN: protéine lié ADN forme encore complex
- libère ADN lié à protéine
- séquençage
