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bio mol II > cours 11 mcb2399 > Flashcards

cours 11 mcb2399 Flashcards

1
Q

comment augmenter la production de protéines

A
  • augmenter copies ADN
  • augmenter ARN
  • augmenter traduction
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Q

en quoi consiste le design des purification

A

isolation à partir des tissus/cellules
production dans un système d’expression: bactérie, levure, cellule mammifère, plante, cellule insecte, in vitro

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3
Q

quels sont les avantages/désavantages de l’expression protéique in vitro

A

+ : pas besoin de clonage, rapide, plusieurs expressions simultanément, production protéines difficiles ou toxiques

  • : cout, faible quantité matériel, ADNc pour protéines eucaryote
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4
Q

en quoi consiste l’expression protéique in vitro

A
  • ajout ADN/ARN pol
  • ribosomes
  • incubation
  • synthèse protéine
  • purification
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5
Q

en quoi consiste l’expression protéique utilisant les bactéries

A

avec des vecteurs:
- promoteur fort
- codons optimisés
- signaux traduction optimisés
- tag affinité pour faciliter purification (his-tag)
- fusion à protéines bactériennes
- épitopes reconnus par Ac

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6
Q

caractéristiques du plasmide pGEX pour expression protéique chez E.coli

A
  • partie N-terminale GST
  • site protéases
  • besoin de cloner dans bon cadre de lecture
  • promoteur inductible à IPTG (possède lac-)
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7
Q

principe de purification des protéines

(globale)

A
  1. lyse cellulaire
  2. centrifugation
  3. précipitation a.n
  4. précipitation protéines
  5. chromatographie
  6. obtention protéine pure
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8
Q

quels sont les procédés de séparation de protéines

A
  • précipitation
  • chromatographie
  • électrophorèse
  • centrifugation
  • ultrafiltration
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9
Q

comment faire la lyse bactérienne

A
  • produits chimiques
  • conditions alcalines
  • traitement enzymatique
  • traitement physique
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10
Q

quels produits chimiques utilisés pour la lyse bactérienne et quel est l’avantage des produits chimiques

A
  • détergent
  • antibio
  • solvants
  • agent dénaturant

moins de chance de dégradation

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11
Q

quels sont les traitements physiques utilisés pour la lyse bactérienne et quels sont leur désavantage

A
  • sonication
  • homogénisation
  • agitation avec abrasifs
  • gel-dégel

possibilité de dénaturer

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12
Q

pourquoi faire des précipitations pour purifier protéines

A
  • éliminer bonne partie des protéines non désirées
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13
Q

comment se fait la précipitation avec le sulfate ammonium

A

salting-out:
bcp sel: provoque agrégation des protéines= précipitation

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14
Q

ions kosmotrope vs chaotrope

A

kosmotrope: sulfate d’ammonium: augmentation concentration permet précipitation stable
ions kosmotropique = ion stabilisant

chaotrope: urée: augmentation concentration cause dénaturation
ion chaotropique = ion dénaturant

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15
Q

à quoi peut servir la dialyse

A

changer composition des solutions:
solution dans membrane semi-perméable: permet échange ions mais pas protéines

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16
Q

comment fonctionne l’ultrafiltration

A

comme dialyse en utilisant centrifugeuse pour faire traverser tampon à travers un filtre

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17
Q

la charge des protéines dépend de quoi

A

séquence a.a (point isoélectrique)
pH solution

18
Q

en chromatographie qu’est-ce que le flow through

A

ce qui n’interagit pas avec résine

19
Q

différence entre gradient linéaire vs en étape en chromatographie

A

linéaire: plus de pics
étape: plus plus larges

20
Q

comment fonctionne la chromatographie d’exclusion/filtration sur gel

A

selon taille: si trop gros: va pas lier pores donc va éluer plus vite

21
Q

caractéristiques de la chromatographie aux interactions hydrophobes

A
  • 8 a.a hydrophobes
  • souvent caché à intérieur protéine
  • résine possède groupements hydrophobes lié au gel agarose
  • utilisation gradient décroissant
22
Q

comment fonctionne la purification des protéines his-tag par chromatographie d’affinité

A
  1. tag protéines avec his
  2. résine: nickel
  3. nickel et his interagissent
  4. élution avec imidazole qui compétitionne avec his
22
Q

quels types de résine peut-on utiliser en chromatographie d’affinité

A
  • Ni-NTA (protéine his-tag)
  • amylose (protéine MBP)
  • glutathione (protéine GST)
  • chitine
  • anticorps spécifiques
23
Q

comment mesurer l’activité proétique par unité d’activité d’une protéine

A

quantité substrat converti en produit final selon le temps et avec des conditions pré-établies
ex: µmol de produit/min

24
Q

comment peut-on mesurer la quantité de protéines

A

-Bradford essay (chimique, lecture spectro)
- absorbance à 280 nm (en temps réel, mais moins précis)
- fluorescence

25
Q

caractéristiques SDS-PAGE

A
  • conditions dénaturantes: pour linéariser protéines
  • coloration après électrophorèse
26
Q

quelles sont les 2 dimensions de SDS-PAGE 2D

A

horizontal: pI
vertical: par taille

27
Q

caractéristique immunoblot/ westernblot

A
  • détection protéine spécifique avec anticorps
  • quantitatif
  • détection colori/fluométrique, chimiolumiscence, radioactivité
28
Q

étapes immunoblot avec luminol

A
  • séparation SDS-PAGE
  • transfert sur membrane
  • blocage région non-spécifiques
  • incubation Ac primaire
  • incubation Ac secondaire lié HRP
  • HRP + peroxydase: H2O et O2 -> oxydation luminol -> produit lumière -> détection
29
Q

comment stabiliser les protéines pendant et après purification

A
  • solution maintien pH
  • baisse T et conservation au froid
  • travailler quick
  • inhiber protéases
  • agents stabilisant: glycérol et BSA
30
Q

qquels sont les 2 types de bio-interactions

A
  • protéine-protéine
  • protéine- a.n.
31
Q

quelles sont les méthodes d’analyses des bio-interactions protéine-protéine

A

in vivo:
- 2 hybrides
- FRET

in vitro:
- immunoprécipitation
- FRET
- phage display

32
Q

en quoi consiste la méthode 2 hybrides pour les bio-interactions

A

fusionne 2 protéines à étudier aux 2 domaines GAL4 (DBD et AD)
domaines de GAL4: un activateur et un lie ADN: besoin de fusionner les 2 domaines pour transcription gène rapporteur

32
Q

quels sont les avantages/inconvénients de la méthode 2 hybrides pour les bio-interactions

A

+: in vivo, quantifiable, faible cout
-: faux négatifs/positifs, besoin clonage pour fusion traductionnelle

33
Q

comment fonctionne la méthode FRET pour les bio-interactions

A

protéines fluorescentes: si les 2 sont proches: émission de lumière

activation protéine 1: émission lumière qui active protéine 2 qui émet une autre lumière

34
Q

FRET se fait in vivo ou in vitro

A

les deux

35
Q

en quoi consiste la méthode pull-down/immunoprécipitation pour les bio-interactions

A
  • si 2 protéines réagissent ensemble: si on purifie 1 l’autre devrait suivre
  • purifie par chromato classique ou affinité, avec billes magnétiques
  • visualisation par SDS-PAGE
  • utilisation tag
36
Q

comment fonctionne la méthode phage display pour les bio-interactions

A
  • peptides spécifiques qui lie capside de phages sont liés à plaque
  • ajout de plusieurs phages: dont 1 devrait lier
  • élution de ce phage puis séquençage
37
Q

quelles sont les méthodes de détections pour les bio-interactions protéines-ADN

A

in vivo:
- ChIP

in vitro:
- retard sur gel (EMSA)
- empreinte sur ADN

38
Q

comment fonctionne la méthode EMSA pour bio-interactions

A

quand protéine lie une autre: va avoir un retard sur le gel vs protéine qui n’a pas liée

peut utiliser supershift: exemple Ac pour un 2e degré de retard sur gel

39
Q

comment fonctionne empreinte sur ADN/footprinting pour les bio-interactions

A
  • fragments sont clivés sauf en endroits ou protéine protège contre clivage
  • va former en trou sur gel où aurait du être la séquence
40
Q

comment fonctionne la méthode ChIP pour bio-interactions

A
  1. fixation ADN-protéine: complex stable
  2. purification ADN: protéine lié ADN forme encore complex
  3. libère ADN lié à protéine
  4. séquençage

bio mol II (12 decks)

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