cours 8 mcb2399 Flashcards
ARNm compte pour quel pourcentage de tous les ARN
1-5%
quelles proportions d’ARN correspondent
les ARNt et ARNr
ARNt: 15-20%
ARNr: 80-85%
quel type d’ARN est codant
ARNm
quelle est la structure du gène bactérien
- promoteur
- séquence tête (dans laquelle se trouve RBS)
- région codante: commençant par AUG
- séquence de queue (commençant avec codon arrêt)
- terminateur
quelles sont les modifications post-transcriptionnelles faites sur un gène eucaryote
- ajout coiffe 5’
- ajout queue poly-A 3’
- épissage (enlever introns)
quelles sont les différences des gènes procaryote vs eucaryote
- ARNm: pro: instable et polycistronique alors que eu: stable et monocystronique
-Transcription/traduction: pro: couplée alors que eu: noyau/cystoplasme - modifications seulement chez eu
pourquoi ecq ARN difficile à isoler
- facilement dégradable par RNase
- instable
quelles sont les précautions à prendre afin d’isoler de l’ARN
- matériel RNase free
- espace réservé
- gants etc
comment isoler ARN total
- lyse
- extraction
- centrifugation
- prélever phase aqueuse
- précipitation
- centrifugation
- obtention ARN total
quelles sont les méthodes d’analyse d’ARN
- électrophorèse (visualiser)
- spectrophotomètre (concentration)
- fluorescence
- radioactivité
- BioAnalyzer
à quoi peut servir l’ARN total isolé
- ARNm
- protection RNase
- Hybridation type Northern
- RT-PCR
- extension amorce
- transcriptome et RNA-seq
comment isoler ARNm des eucaryotes
- avec billes magnétiques Oligo d(T) qui capture la queue polyA des ARNm
comment se fait l’hybridation de type Northern
- extraction ARN
- électrophorèse avec gel dénaturant
- transfert sur membrane
- hybridation à sonde
- révélation
quelles sont les applications des Northern
- détection: présence, localisation, détecter formes épissage chez eucaryotes
- quantification: abondance, mesurer et/ou expression
que permet un gène normalisateur lorsqu’on compare l’expression
permet de déterminer la quantité basale exprimée
comment fonctionne la protection à la RNase
hybridation avec sonde
permet de protéger et permet de détecter par la suite
comment fonctionne la RT-PCR
transcriptase inverse: ARN en ADNc
1. mettre tous réactifs pour RT et PCR (amorces, RT, ADN pol, autres)
ou
1. RT: amorces aléatoires, RT pour former ADNc
2. PCR: amorces spécifiques, ADN pol, autres
que permet la RT-PCR
- détection gène à partir peu d’ARN
- expression absolue ou relatif, quantitatif ou qualitatif
quel est l’outil le plus puissant, sensible et quantitatif pour détecter ARN
q-RT-PCR
caractéristiques q-RT-PCR
- RT et PCR quantitatif (fluorescence avec Taqman) permet déterminer nombre de copies
- utilisation gène normalisateur
quels sont les différents ARN non codants
non régulateur:
- ARNt et ARNr
régulateur:
- petits ARN
- ARN antisens
- ARN CRISPR
- riboswitch
- ARN interférence
quelles sont les caractéristiques des sARN
- 50-500 pb
- cis ou trans (aidé par Hfq)
- plusieurs cibles possibles
- appariement sARN-ARNm dans région non-traduite de ARNm
- fonction régulatrice
- activation ou inhibition traduction
- dégradation ARNm
caractéristiques ARN interférance (RNAi)
- régulation
- dégradation ARN double brin
- siRNA avec complexe RISC scan l’ARNm et si siARN est complémentaire à ARNm: RISC coupe
à quoi peuvent servir les RNAi
pour prévenir l’expression de gènes (gene silencing)
si ARNm mutant: siRNA va dégrader cet ARNm mutant pour arrêter progression de maladie
que signifie CRISPR
clustered regulatory interspaced short palindromic repeats
qu’est-ce que la région leader du système CRISPR-Cas
région AT riche avec promoteur
site insertion de nouvelles séquences spacer
quel est le mécanisme de CRISPR-Cas
- CRISPR et spacer sont transcrit en ARN
- chaque ARN CRISPR/spacer est coupé pour former des crARN
- spacer sont complémentaire à ADN viral/plasmidique
- quand spacer s’hybride avec ARNg: Cas dégrdation
- coupure dans ADN phagique/plasmidique: deadly
d’où proviennet les nouveaux spacers
- séq ADN étranger introduit dans locus CRISPR
- spacer inséré du côté du leader
combien y a-t-il de classe et types de CRISPR
2 classes et 6 types
le plus important pour le cours: type II de classe II (CRISPR-Cas9)
à quoi sert CRISPR-Cas9 chez les bactéries
- typage
- vaccination contre phages
- antimicrobien
- coupure double brin: léthale
ajout recombinase permet édition du génome (pas juste couper)
qu’est-ce que la séquence PAM
séq de reconnaissance chez Cas9
qu’est-ce que l’ARN guide
fusion tracrRNA et crRNA + cas9
quelles types de manipulation génétiques peuvent être faites avec CRISPR-Cas9
- délétion
- insertion
- mutation
- activation
- répression
- visualisation
- fusion
- épigénétique
à quoi peut servir CRISPR-Cas9 dans le médical
(est-ce vrm important?)
- identification cancer
- extraction VIH
- destruction pathogène
- éliminer paludisme
- protection plantes
- production nourriture et biocarburant
