cours 1 mcb2399 Flashcards
à quoi sert le séquençage
d’ADN
- structure génomes et phylogénie
- déterminer structure d’un gène et sa fonction
- détecter polymorphisme
- analyser variations génétiques
- prédire produits possibles de fragments d’ADN
quelles sont les 2 méthodes de séquençage de l’ADN
chimique: Maxam-Gilbert
enzymatique: Sanger
que sont les étapes de séquençage chimique
- dégrader ADN
- digestion ADN
- déphosphorylation 5’ pour marquer au 32P ATP avec ADN kinase
- couper avec enzyme de restriction pour avoir 1 seul 5’ marqué
- ADN dans des tubes de G, A+G, C+T et C
que signifie apurinique ou apyrimidique
base sans purine/pyrimidine
dépurination arrive avec de la chaleur
comment se fait la dégradation chimique de purine/pyrimidine
- méthylé par DMS (diméthylsulfate)
- avec chaleur: devient apurinique
- clivage à ce nucléotide apurinique
pour pyrimidine: même chose mais modifié avec hydrazine pas DMS
quelles sont les conditions de dénaturation pour de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide
urée 8M et température de gel à 55-60°C
comment déterminer si la base est un A ou un T avec la méthode de Maxam-Gilbert
comme A+G mélangé ou C+T: doit comparer les bandes sur gel
si voit deux puits au et au A+G = G
si un seul puit au A+G et aucun G: A
pourquoi la technique de Maxam-Gilbert n’est plus utilisée
- réactifs doivent être très frais et purs
- produits radioactif, toxic, explosif
- besoin de 2 gels de polyacrylamide: 20% pour nucléotides proche du site de marquage et 8% pour ceux qui sont loin
- même avec 8% polyacrylamide: seulement 300nt
en quoi consiste la méthode enzymatique/Sanger
utilisation d’une ADN pol qui synthétise un 2e brin
lorsque ddNTP est placé: arrêt de l’élongation
dans la méthode de Sanger quel réactif est utilisé pour le marquage
avant faisait avec 32P mais ensuite avec 35S car meilleur résolution (sur gel meilleure séparation= meilleure lecture)
avec Sanger peut-on directement identifié les nucléotides A et T
oui
que permet les ddNTP couplé à des fluorochromes de couleurs différentes
- permet faire électrophorèse en capillaire et en continue (meilleure résolution et plus longue séquence)
- se fait dans un seul tube et non 4
comment localiser le site d’intiation d’un gène
- a partir d’un ARN: lier une amorce marquée radioactivement
- élongation par RT (reverse transcriptase)
jusqu’a 5’: qui est le site d’initiation
