cours 5 mcb2399

Question 1

pourquoi extraire ADN

Answer 1

• isoler/cloner gènes/séq particulière
• déterminer séquence d’un génome pour identifier ses gènes

Question 2

quelles sont les étapes d’extraction ADN de cellules bactériennes

Answer 2

1. lyse cellulaire
2. élimination des protéines-phénol
3. élimination ADN et précipiation à alcool

possibilité élimination protéine sans phénol ni précipitation alcool

Question 3

comment fonctionne la lyse cellulaire pour extraction ADN de cellules bactériennes

Answer 3

1. traitement au lyzozyme pour dégrader peptidoglycans de paroi
2. traitement SDS (détergent): dissoudre lipides de membrane
3. utilisation agent chélateur EDTA pour élimier ions de membrane externe (Gram -)

Question 4

que se passe-t-il dans étape élimination protéine avec phénol pour extraction ADN cellules bactériennes

Answer 4

après lyse: 1. centrifugation: ADN haut poids moléculaire et autres composantes reste en solution

2. ajout phénol: ADN/ARN se trouve dans phase aqueuse alors que protéines sont dans fond avec phénol

Question 5

que se passe-t-il dans étape élimination ARN et précipitation à alcool pour extraction ADN cellules bactériennes

Answer 5

1. ribonucléase dégrade ARN, pas ADN
2. ajout alcool: précipitation ADN
3. centrifugation pour sédimenter ADN
4. culot ADN resuspendu dans eau tamponnée

Question 6

que se passe-t-il dans le protocole alternatif (pas de phénol ni alcool) pour extraction ADN cellules bactériennes

Answer 6

passage dans colonne contenant résine liant ADN:
- résine silice lie ADN à bas pH et [sels] élevées
- résines échangeuse ions (positive) lie ADN (négatif) à faibles [sels]

Question 7

quel est l’inconvénient d’utiliser électrophorèse pour visualiser et analyser ADN

Answer 7

électrophorèse: sépare molécule selon charge
ADN est négatif: migre vers pole positif, même si fragments de différentes longueurs: ont tous même charge donc permet pas de séparer ADN selon taille

Question 8

sur quel type de gel sont séparés les fragments ADN courts de quelques centaines de nt vs plus long

Answer 8

long: agarose
court: polyacrylamide

Question 9

à quoi peut servir l’électrophorèse en gel d’agarose pour ADN

Answer 9

• purifier fragments ADN (prend bande sur gel)
• déterminer taille des fragments en utilisant un étalon dont connait taille

Question 10

comment visualiser ADN sur gel d’agarose par électrophorèse

Answer 10

1. tremper dans solution bromure éthidium (agent intercalant)
2. sous lampe UV: bromure devient orange

Question 11

pour quelle longueur de fragments ecq PFGE (électrophorèse en champs pulsés) est utilisé

Answer 11

gros fragments (possible de séparer un chromosome complet)

Question 12

comment fonctionne électrophorèse en champs pulsés

Answer 12

électrodes en hexagone avec pulsations: molécules font zigzag
molécules plus courtes vont voyager plus rapidement en zigzag que les gros

Question 13

à quoi peut servir PFGE

Answer 13

vérifier si un chromosome a été fragmenté (exemple par stress)

chromosome circulaire migre pas dans PFGE: si subit cassure: ouvre chromosome et va fragmenter pour former des bandes

Question 14

que permet DGGE (électrophorèse sur gel en gradient dénaturant)

Answer 14

• sépare ADN qui ont différence de 1 nt
• utilisé pour analyse mutation (substitutions) ADN ne doit pas changer de longueur

Question 15

comment fonctionnne DGGE

Answer 15

• pour fragments de quelques centaines pb
• gradient dénaturation : sépare double brins
• ADN partiellement dénaturé migre plus lentement

séparation double brin dépend séquence ADN, un changement de 1 nt va changer dénaturation donc va changer vitesse migration

Question 16

à quoi est dû la dénaturation sur DGGE

Answer 16

• température quand même élevée et constante
• dénaturation chimique avec gradient urée et formamide

Question 17

DGGE en parallèle vs perpendiculaire

Answer 17

selon direction du gradient de dénaturation (urée formamide): augmentation gradient permet voir différents allèles

parallèle: bande position unique
perpendiculaire: grand puits avec tous les échantillons, formation bande sigmoïde

Question 18

à quoi ça sert de synthétiser un ADN

Answer 18

souvent pour créer des amorces pour PCR ou séquençage

Question 19

comment synthétiser chimiquement de l’ADN

Answer 19

1. attache 1er nt à une bille de verre via un spacer (spacer empêche les autres nt de se fixer à bille)
2. ajout des autres nt un à la fois (plusieurs cycles)
   - synthèse se fait de 3’ vers 5’
   - utilisation nt phosphoramidite = avec un phosphate
   - pour empêcher ajout nt en 5’: bloque 5’ avec DMT et 3’ activé par phosphoramidite

Question 20

comment mesurer la concentration de ADN et ARN

Answer 20

lumière UV: ADN absorbe à 260nm alors que protéines à 280nm

permet évaluer pureté: pur = ratio ADN/protéine 1,8 et ARN/protéine 2,0

ADN absorbe moins que ARN

Question 21

à cause de quel groupement ecq l’ADN/ARN et les protéines absorbent lumière UV

Answer 21

groupements aromatiques