cours 10 mcb2399 Flashcards
différence entre clonage directionnel et non directionnel
non directionnel: utilisation de la même enzyme de restriction: pas de sens à l’insert
directionnel: 2 enzymes de restrictions différentes: oriente insert d’une certaine façon
quel est l’avantage du clonage directionnel
obtention de insert dans sens désiré permet bonne expression pcq dans bonne orientation selon promoteur
quel problème peut causer les 2 orientations du clonage non-directionnel
seulement 1/2 va pouvoir être transcrit pcq pas dans la bonne orientation selon le promoteur
que doit-on tenir en compte quand on fait une digestion double
2 enzymes: 2 conditions de réactions différentes qui doivent être prises en compte
que se passe-t-il si on adapte pas les conditions de réactions des 2 enzymes de restrictions
- digestion partielle
- activité étoile
peut-on faire un clonage directionnel avec deux enzymes différentes qui génèrent des bouts francs
possible mais ne donnera pas un clonage directionnel, bouts pas spécifiques
peut-on faire clonage directionnel avec 1 enzyme qui fait bout franc et l’autre qui fait bout cohésif?
oui pcq donne deux bouts différents
peut-on faire un clonage non-directionnel avec 2 enzymes de restrictions différentes
oui: 2 enzymes peuvent générer le même bout cohésifs sans couper exactement la même séquence
comment choisir ses enzymes de restriction pour un clonage
- souvent veut 2 enzymes différentes qui font des bouts cohésifs
- vérifier pas site restriction dans insert
- vérifier conditions des 2 enzymes
quoi faire si un des deux enzyme possède un site de restriction dans insert
- mutagénèse dirigée pour enlever le site
- faire clonage non directionnel
- utiliser autre enzyme
comment s’assurer de l’efficacité des digestions
faire digestion simple de chaque enzyme avec le vecteur de clonage:
devrait être linéaire
sur gel:
- en haut: circulaire
- milieu: linéaire
- en bas: surenroulé
quelle est l’étape entre la digestion et ligation
inactivation/élimination enzymes de restriction par chaleur ou purification ADN digéré
que fait la ligase T4
- lie extrémité 5’P et 3’OH
- besoin ATP
- inactivé par chaleur
pourquoi faire la ligation à 16°C alors que la ligase fonctionne mieux à 37°C
à 37: extrémités sont moins stables donc ligation plus difficile même si l’enzyme fonctionne mieux
16: enzyme fonctionne toujours (mais moins bien) et les extrémités sont plus stables
comment lier efficacement des bouts francs
efficacité faible:
dépend de la probabilité de contact moléculaire selon mouvement brownien et concentration ADN
pourquoi doit-on avoir un ratio entre insert et vecteur pour la ligation
pcq étape la moins efficace:
pour optimiser besoin ratio insert/vecteur 3:1
(selon nombre de molécules)
que se passe-t-il si le ratio insert:vecteur 3:1 est diminué vs augmenté
diminué exemple 1:1: vecteur se recircularise sans insert
augmente 9:1:
plusieurs inserts dans un vecteur
comment s’assurer que la ligation a bien été effectuée
patron sur gel différent: vecteur circularisé va être plus haut que vecteur linéaire digéré avec même enzyme
comment réduire la probabilité de sélectionner vecteur parental après la transformation
- purifier vecteur digéré sur gel
- déphosphorylation vecteur par phosphatase
- digestion avec enzyme de restriction dans insert parental
comment se fait la purification sur gel du vecteur digéré
éliminer le vecteur parental digéré: va former 2 fragments et ne sera pas capable de recirculariser à cause des bouts cohésifs non compatibles
comment éviter de prendre le vecteur parental avec la technique de déphosphorylation du vecteur
- après digestion: déphosphoryle 5’P pour empêcher la recircularisation si on a utilisé clonage non directionnel
- déphosphorylation par phosphatase provenant crevette et est inactivée par chaleur
qu’est-ce que la transformation d’ADN
insert ADN extracellulaire dans une cellule
qu’est-ce que la compétence bactérienne
capacité d’une cellule à recevoir ADN extracellulaire
comment induire la compétence cellulaire et la transformation
lavage avec chlorure de calcium/rubidium et incubation sur glace
comment le chlorure de calcium/rubidium rend les cellules compétentes
sels avec cations divalents qui neutralisent les charges des acides téichoiques ou LPS des bactéries
comment les chocs thermiques permettent la transformation
changement de température déstabilise enveloppe bactérienne
glace-42°C-glace-milieu riche (permet récupération)
qu’est-ce que l’électroporation et à quoi ça sert
pour transformation par courant électrique: forme pores dans enveloppe bactérienne
lavages au glycérol et incubation sur glace pour éliminer sels (pcq diminue efficacité électroporation)
quelle est la méthode la plus efficace pour la transformation bactérienne
électroporation
efficacité de la transformation est meilleure avec de l’ADN surenroulé ou non
surenroulé
comment vérifier que la transformation a bien été effectuée
étalement sur milieu sélectif avec antibiotiques
comment confirmer la construction moléculaire
PCR ou digestion
puis: séquençage
quels sont les problèmes qui diminuent les chances d’un bon clonage moléculaire
- mauvaise qualité ADN
- faible efficacité digestion ou activité étoile
- faible efficacité ligation
- faible efficacité transformation
- sélection vecteur parental après transformation
qu’est-ce qu’un plasmide navette
plasmides qui peuvent se reproduire et être sélectionn dans plus d’un organisme
bactérie à levure ou bactérie à cellule mammifère
