cours 10 mcb2399

Question 1

différence entre clonage directionnel et non directionnel

Answer 1

non directionnel: utilisation de la même enzyme de restriction: pas de sens à l’insert

directionnel: 2 enzymes de restrictions différentes: oriente insert d’une certaine façon

Question 2

quel est l’avantage du clonage directionnel

Answer 2

obtention de insert dans sens désiré permet bonne expression pcq dans bonne orientation selon promoteur

Question 3

quel problème peut causer les 2 orientations du clonage non-directionnel

Answer 3

seulement 1/2 va pouvoir être transcrit pcq pas dans la bonne orientation selon le promoteur

Question 4

que doit-on tenir en compte quand on fait une digestion double

Answer 4

2 enzymes: 2 conditions de réactions différentes qui doivent être prises en compte

Question 5

que se passe-t-il si on adapte pas les conditions de réactions des 2 enzymes de restrictions

Answer 5

• digestion partielle
• activité étoile

Question 6

peut-on faire un clonage directionnel avec deux enzymes différentes qui génèrent des bouts francs

Answer 6

possible mais ne donnera pas un clonage directionnel, bouts pas spécifiques

Question 7

peut-on faire clonage directionnel avec 1 enzyme qui fait bout franc et l’autre qui fait bout cohésif?

Answer 7

oui pcq donne deux bouts différents

Question 8

peut-on faire un clonage non-directionnel avec 2 enzymes de restrictions différentes

Answer 8

oui: 2 enzymes peuvent générer le même bout cohésifs sans couper exactement la même séquence

Question 9

comment choisir ses enzymes de restriction pour un clonage

Answer 9

• souvent veut 2 enzymes différentes qui font des bouts cohésifs
• vérifier pas site restriction dans insert
• vérifier conditions des 2 enzymes

Question 10

quoi faire si un des deux enzyme possède un site de restriction dans insert

Answer 10

• mutagénèse dirigée pour enlever le site
• faire clonage non directionnel
• utiliser autre enzyme

Question 11

comment s’assurer de l’efficacité des digestions

Answer 11

faire digestion simple de chaque enzyme avec le vecteur de clonage:
devrait être linéaire
sur gel:
- en haut: circulaire
- milieu: linéaire
- en bas: surenroulé

Question 12

quelle est l’étape entre la digestion et ligation

Answer 12

inactivation/élimination enzymes de restriction par chaleur ou purification ADN digéré

Question 13

que fait la ligase T4

Answer 13

• lie extrémité 5’P et 3’OH
• besoin ATP
• inactivé par chaleur

Question 14

pourquoi faire la ligation à 16°C alors que la ligase fonctionne mieux à 37°C

Answer 14

à 37: extrémités sont moins stables donc ligation plus difficile même si l’enzyme fonctionne mieux

16: enzyme fonctionne toujours (mais moins bien) et les extrémités sont plus stables

Question 15

comment lier efficacement des bouts francs

Answer 15

efficacité faible:
dépend de la probabilité de contact moléculaire selon mouvement brownien et concentration ADN

Question 16

pourquoi doit-on avoir un ratio entre insert et vecteur pour la ligation

Answer 16

pcq étape la moins efficace:
pour optimiser besoin ratio insert/vecteur 3:1
(selon nombre de molécules)

Question 17

que se passe-t-il si le ratio insert:vecteur 3:1 est diminué vs augmenté

Answer 17

diminué exemple 1:1: vecteur se recircularise sans insert

augmente 9:1:
plusieurs inserts dans un vecteur

Question 18

comment s’assurer que la ligation a bien été effectuée

Answer 18

patron sur gel différent: vecteur circularisé va être plus haut que vecteur linéaire digéré avec même enzyme

Question 19

comment réduire la probabilité de sélectionner vecteur parental après la transformation

Answer 19

• purifier vecteur digéré sur gel
• déphosphorylation vecteur par phosphatase
• digestion avec enzyme de restriction dans insert parental

Question 20

comment se fait la purification sur gel du vecteur digéré

Answer 20

éliminer le vecteur parental digéré: va former 2 fragments et ne sera pas capable de recirculariser à cause des bouts cohésifs non compatibles

Question 21

comment éviter de prendre le vecteur parental avec la technique de déphosphorylation du vecteur

Answer 21

• après digestion: déphosphoryle 5’P pour empêcher la recircularisation si on a utilisé clonage non directionnel
• déphosphorylation par phosphatase provenant crevette et est inactivée par chaleur

Question 22

qu’est-ce que la transformation d’ADN

Answer 22

insert ADN extracellulaire dans une cellule

Question 23

qu’est-ce que la compétence bactérienne

Answer 23

capacité d’une cellule à recevoir ADN extracellulaire

Question 24

comment induire la compétence cellulaire et la transformation

Answer 24

lavage avec chlorure de calcium/rubidium et incubation sur glace

Question 25

comment le chlorure de calcium/rubidium rend les cellules compétentes

Answer 25

sels avec cations divalents qui neutralisent les charges des acides téichoiques ou LPS des bactéries

Question 26

comment les chocs thermiques permettent la transformation

Answer 26

changement de température déstabilise enveloppe bactérienne
glace-42°C-glace-milieu riche (permet récupération)

Question 27

qu’est-ce que l’électroporation et à quoi ça sert

Answer 27

pour transformation par courant électrique: forme pores dans enveloppe bactérienne

lavages au glycérol et incubation sur glace pour éliminer sels (pcq diminue efficacité électroporation)

Question 28

quelle est la méthode la plus efficace pour la transformation bactérienne

Answer 28

électroporation

Question 29

efficacité de la transformation est meilleure avec de l’ADN surenroulé ou non

Answer 29

surenroulé

Question 30

comment vérifier que la transformation a bien été effectuée

Answer 30

étalement sur milieu sélectif avec antibiotiques

Question 31

comment confirmer la construction moléculaire

Answer 31

PCR ou digestion
puis: séquençage

Question 32

quels sont les problèmes qui diminuent les chances d’un bon clonage moléculaire

Answer 32

• mauvaise qualité ADN
• faible efficacité digestion ou activité étoile
• faible efficacité ligation
• faible efficacité transformation
• sélection vecteur parental après transformation

Question 33

qu’est-ce qu’un plasmide navette

Answer 33

plasmides qui peuvent se reproduire et être sélectionn dans plus d’un organisme
bactérie à levure ou bactérie à cellule mammifère