cours 7 mcb2399

Question 1

quelles sont les étapes du clonage moléculaire

Answer 1

1. digestion ADN d’intérêt par enzymes de restriction: formation insert
2. digestion vecteur clonage par même enzymes de restriction
3. ligation insert-vecteur: plasmide recombinant
4. transformation dans cellules déjà compétentes
5. isolement plasmide et confirmation construction moléculaire par PCR et séquençage

Question 2

quelles sont les utilités du clonage

Answer 2

• surexpression protéine homologue ou hétérologue
• expression de gènes pour études
• fusion promoteur pour études de transcription
• criblage génétique
• séquençage

Question 3

éléments d’un gène

Answer 3

• séq ADN codant pour protéine avec codon ATP/STOP
• promoteur
• RBS

Question 4

quels éléments d’un gène sont différents chez les eucaryotes

Answer 4

• introns
• pas RBS mais boîte Kozak (séq GC avec une purine souvent A)
• séq équivalent à RBS: IRES (traduction très efficace)

Question 5

comment obtenir un insert

Answer 5

• produit de PCR spécifique
• plasmides recombinants
• gène synthétique
• provenant phage, virus,etc

Question 6

caractéristiques des enzymes de restriction

Answer 6

endonucléase: coupe à intérieur ADN donc important ajouter nt sur les amorces

coupe séq spécifique reconnue (site de reconnaissance)

Question 7

facteurs à considérer lorsque fait amorces pour ajouter sites restriction

Answer 7

• critères de PCR: tm, longueur, structure secondaire
• localisation des amorces
• ajout séq de reconnaissance des enzymes amont/aval de séq
• ajout environ 6 nt en 5’ sur chaque amorce

Question 8

à quoi peuvent servir les amorces

(autre que amplifier gène et ajouter sites restriction)

Answer 8

• ajouter des séquences aux produits de PCR
• réaliser mutagénèse dirigée

Question 9

exemples d’amorces de type foward

Answer 9

• section homolgue avec gène
• rbs
• site restriction
• nt en extra en 5’

Question 10

exemple d’amorce type reverse

Answer 10

• section homologue avec gène
• fusion traductionnelle
• codon stop
• site restriction
• nt en extra en 5’

Question 11

à quoi sert la mutagénèse dirigée avec amorce

Answer 11

• corriger mutation non conservative introduite pendant PCR
• introduire une mutation non conservation pour inactiver enzyme
• introduire mutation conservative pour éliminer site restriction

Question 12

que sont des vecteurs de clonage

Answer 12

ADN circulaire extrachromosomique capable de se répliquer dans cellules via origine de réplication qui utilise machinerie de l’hôte (plasmide)

Question 13

que sont les groupes d’incompatibilité et que causent-ils

Answer 13

groupes dans lesquels les plasmides sont classés: par leur même origine de réplication

deux plasmides du même groupe: ne fonctionne pas

Question 14

plasmides à une copie vs plasmides multi-copies

Answer 14

1 copie: se répliquer 1 fois par cycle cellulaire (pendant réplication)

multi-copies: réplique n’importe quel moment

Question 15

comment les plasmides assurent leur conservation dans l’hôte

Answer 15

plasmides codent pour système toxine/antitoxine:
toxine est une antibactérien et antitoxine empêche son action
- si cellule fille ne contient pas plasmide: tuée par la toxine (qui était présente chez cellule mère)
- contient plasmide: antitoxine inhibe la toxine

exemple: ColE1: colicine: antibactérien

Question 16

quelles sont les manipulations effectuées sur plasmide ColE1 pour la bio mol

Answer 16

• change gène toxine/antitoxine pour gène résistance antibiotique
• ajout sites de clonage multiples (contient plusieurd sites reconnaissance d’enzymes de restriction
• séq promotrice en 5’
• desfois: séquence RBS

Question 17

ecq c’est important d’avoir une séq RBS pendant clonage

Answer 17

oui pour permettre expression protéique
peut se trouver sur la séq du gène à cloner ou ajouté sur amorce type foward

Question 18

pourquoi ecq la distance entre RBS et codon ATG est importante

Answer 18

pour efficacité traduction

Question 19

à quoi servent les vecteurs

Answer 19

• maintien des inserts
• régulation expression des gènes
• fusion transcriptionnelle/traductionnelle

Question 20

différence entre fusion transcriptionnelle vs traductionnelle par vecteur

Answer 20

transcriptionnelle: 2 gènes: chaque gène possède son RBS mais utilise 1 promoteur

traductionnelle: 2 gènes collés: 2e gène utilisé comme gène rapporteur

Question 21

d’où provient les enzymes de restriction

Answer 21

mécanisme défense bactérien contre bactériophage

Question 22

caractéristiques des enzymes de restriction de type I

Answer 22

• coupe après séquence de reconnaissance (distance de la coupe variable)
• 3 sous-unités: lie site de reconnaissance, méthyle ADN reconnu, digère ADN en aval de méthylation
• type suicide: inactivé après 1 ronde
• peu commune en bio mol

Question 23

caractéristiques enzymes restriction type II

Answer 23

• coupe dans site de reconnaissance
• 1 unité
• plusieurs rondes sans être inactivé

Question 24

que fait la méthylase

Answer 24

ajout CH3 sur A pour empêcher liaison avec enzyme de restriction

Question 25

ecq les gènes pour enzyme de restriction et méthylase sont situés proche

Answer 25

oui: font partie même opéron pour assurer expression en même temps

Question 26

que veut dire palindromique

Answer 26

même séquence dans 2 sens

Question 27

quantité et rapidité des enzymes de restriction

Answer 27

unité active: 1 unité digère 1µg ADN/heure à température optimale dans volume de 50 µl

utilisé en excès (5-10x)

Question 28

ecq enzymes de restrictions font bouts cohésifs ou francs

Answer 28

les deux, mais meilleur clonage avec cohésifs

Question 29

nomenclature enzyme restriction EcoRI

Answer 29

E: genre de la bactérie
co: espèce bactérie
R: souche
I: pcq 1ere enzyme commercialisée

Question 30

qu’est-ce qu’une enzyme de restriction avec activité étoile

Answer 30

quand conditions pas optimales: perdent spécificité et coupent ailleurs que site de reconnaissance

Question 31

comment inactiver enzymes de restriction

Answer 31

avec chaleur

Question 32

que sont les enzymes de restrictions HF

Answer 32

haute fidélité: moins/aucune activité étoile