cours 7 mcb2399 Flashcards
quelles sont les étapes du clonage moléculaire
- digestion ADN d’intérêt par enzymes de restriction: formation insert
- digestion vecteur clonage par même enzymes de restriction
- ligation insert-vecteur: plasmide recombinant
- transformation dans cellules déjà compétentes
- isolement plasmide et confirmation construction moléculaire par PCR et séquençage
quelles sont les utilités du clonage
- surexpression protéine homologue ou hétérologue
- expression de gènes pour études
- fusion promoteur pour études de transcription
- criblage génétique
- séquençage
éléments d’un gène
- séq ADN codant pour protéine avec codon ATP/STOP
- promoteur
- RBS
quels éléments d’un gène sont différents chez les eucaryotes
- introns
- pas RBS mais boîte Kozak (séq GC avec une purine souvent A)
- séq équivalent à RBS: IRES (traduction très efficace)
comment obtenir un insert
- produit de PCR spécifique
- plasmides recombinants
- gène synthétique
- provenant phage, virus,etc
que sont des enzymes de restriction
endonucléase: coupe à intérieur ADN donc important ajouter nt sur les amorces
coupe séq spécifique reconnue (site de reconnaissance)
facteurs à considérer lorsque fait amorces pour ajouter sites restriction
- critères de PCR: tm, longueur, structure secondaire
- localisation des amorces
- ajout séq de reconnaissance des enzymes amont/aval de séq
- ajout environ 6 nt en 5’ sur chaque amorce
à quoi peuvent servir les amorces
(autre que amplifier gène et ajouter sites restriction)
- ajouter des séquences aux produits de PCR
- réaliser mutagénèse dirigée
exemples d’amorces de type foward
- section homolgue avec gène
- rbs
- site restriction
- nt en extra en 5’
exemple d’amorce type reverse
- section homologue avec gène
- fusion traductionnelle
- codon stop
- site restriction
- nt en extra en 5’
à quoi sert la mutagénèse dirigée avec amorce
- corriger mutation non conservative introduite pendant PCR
- introduire une mutation non conservation pour inactiver enzyme
- introduire mutation conservative pour éliminer site restriction
que sont des vecteurs de clonage
ADN circulaire extrachromosomique capable de se répliquer dans cellules via origine de réplication qui utilise machinerie de l’hôte (plasmide)
que sont les groupes d’incompatibilité et que causent-ils
groupes dans lesquels les plasmides sont classés: par leur même origine de réplication
deux plasmides du même groupe: ne fonctionne pas
plasmides à une copie vs plasmides multi-copies
1 copie: se répliquer 1 fois par cycle cellulaire (pendant réplication)
multi-copies: réplique n’importe quel moment
comment les plasmides assurent leur conservation dans l’hôte
plasmides codent pour système toxine/antitoxine:
toxine est une antibactérien et antitoxine empêche son action
- si cellule fille ne contient pas plasmide: tuée par la toxine (qui était présente chez cellule mère)
- contient plasmide: antitoxine inhibe la toxine
exemple: ColE1: colicine: antibactérien
quelles sont les manipulations effectuées sur plasmide ColE1 pour la bio mol
- change gène toxine/antitoxine pour gène résistance antibiotique
- ajout sites de clonage multiples (contient plusieurd sites reconnaissance d’enzymes de restriction
- séq promotrice en 5’
- desfois: séquence RBS
ecq c’est important d’avoir une séq RBS pendant clonage
oui pour permettre expression protéique
peut se trouver sur la séq du gène à cloner ou ajouté sur amorce type foward
pourquoi ecq la distance entre RBS et codon ATG est importante
pour efficacité traduction
à quoi servent les vecteurs
- maintien des inserts
- régulation expression des gènes
- fusion transcriptionnelle/traductionnelle
différence entre fusion transcriptionnelle vs traductionnelle par vecteur
transcriptionnelle: 2 gènes: chaque gène possède son RBS mais utilise 1 promoteur
traductionnelle: 2 gènes collés: 2e gène utilisé comme gène rapporteur
d’où provient les enzymes de restriction
mécanisme défense bactérien contre bactériophage
caractéristiques des enzymes de restriction de type I
- coupe après séquence de reconnaissance (distance de la coupe variable)
- 3 sous-unités: lie site de reconnaissance, méthyle ADN reconnu, digère ADN en aval de méthylation
- type suicide: inactivé après 1 ronde
- peu commune en bio mol
caractéristiques enzymes restriction type II
- coupe dans site de reconnaissance
- 1 unité
- plusieurs rondes sans être inactivé
que fait la méthylase
ajout CH3 sur A pour empêcher liaison avec enzyme de restriction
ecq les gènes pour enzyme de restriction et méthylase sont situés proche
oui: font partie même opéron pour assurer expression en même temps
que veut dire palindromique
même séquence dans 2 sens
quantité et rapidité des enzymes de restriction
unité active: 1 unité digère 1µg ADN/heure à température optimale dans volume de 50 µl
utilisé en excès (5-10x)
ecq enzymes de restrictions font bouts cohésifs ou francs
les deux, mais meilleur clonage avec cohésifs
nomenclature enzyme restriction EcoRI
E: genre de la bactérie
co: espèce bactérie
R: souche
I: pcq 1ere enzyme commercialisée
qu’est-ce qu’une enzyme de restriction avec activité étoile
quand conditions pas optimales: perdent spécificité et coupent ailleurs que site de reconnaissance
comment inactiver enzymes de restriction
avec chaleur
que sont les enzymes de restrictions HF
haute fidélité: moins/aucune activité étoile
