cours 6 mcb2399

Question 1

exemples de radioisotypes utilisés pour marquage ADN et leurs avantages

Answer 1

P32: petite demie-vie de 14 jours
S35: demie-vie 88 jours et faible énergie émission donne bande plus précises, mais dois modifier ADN pour incorposer soufre: dérivé phosphorothiate

Question 2

qu’est-ce qu’un phosphorothiate

Answer 2

groupe phosphate qui au lieu d’avoir 4 oxygène : 3 oxygène et 1 S35

Question 3

quelles sont les 2 méthodes pour mesurer la radioactivité pour détecter ADN marqué

Answer 3

• comptage à scintillation: si dans un liquide ou sur papier filtre
• autoradiographie: si dans gel

Question 4

comment fonctionne le comptage à scintillation pour détecter ADN marqué radioactivement

Answer 4

scintillants (produits chimiques) émettent pulsation lumière quand électrons relâché par isotype

ADN radioactif émet beta-particules -> excite scintillants -> émet lumière -> détecté par cellule photoélectrique lié a compteur scintillation enregistre le nombre de pulse de lumière

Question 5

comment fonctionne autoradiographie pour détecter ADN marqué radioactivement

Answer 5

fait gel électrophorèse avec ADN radioactif
fait sécher gel avec film par dessus
sur le film: voit les bandes: permet déterminer séquence nt ou poids moléculaire

Question 6

quel est avantage et inconvénient de radio-isotopes

Answer 6

avantage: utilise quand besoin grande sensibilité
inconvénient: dangereux et demi-vie

Question 7

quelle méthode moins dangereuse est utilisée pour détecter ADN au lieu radio-isotope

Answer 7

fluorescence

Question 8

comment utiliser la fluorescence pour détecter ADN

Answer 8

lie ADN à colorants fluorescents et utilise différentes couleurs pour les nt

chaque nt lié la tag fluorescent

Question 9

comment utiliser fluorescence et cytométrie pour trier cellules mortes/vivantes

Answer 9

cellules vivantes incorporent les nt fluorescents alors que les mortes pas incorporation pcq pas de réplication
cytométrie trie fluorescents vs non-fluorescent

Question 10

à quoi servent la biotine et digoxigénine

Answer 10

marqueurs ADN liés à uracil
incorpore dUTP-biotine/digoxigénine même dans ADN

Question 11

comment détecter biotine et dogoxigénine dans ADN

Answer 11

1. avidine lie biotine ou Ac li digoxigénine: liés à enzyme qui fait couleur
2. phosphate alkaline-avidine: coupe groupe phosphate de X-phos donne couleur bleu OU coupe le lumi-phos (chémiluminescence) fait de la lumière quand coupé

Question 12

avec quelle méthode est-il possible de détecter ADN directement dans la cellule (pas extrait ADN)

Answer 12

analogue thymine: EdU
Alexa Fluor se fixe a EdU
permet visualiser réplication dans cellule

et FISH

Question 13

différence entre EdU et BrdU (analogue thymine) pour la détection ADN

Answer 13

EdU: mesure incorporation niveau cellulaire
BrdU: reconnu par Ac trop gros pour entrer dans cellule, besoin extrait ADN

Question 14

ecq différentes ADN ont le même Tm (température fusion/dénaturation)

Answer 14

non Tm spécifique à chaque fragment pcq composition en nt est spécifique à chaque

Question 15

quelles interactions entre Gc ou AT se dénaturent plus rapidement et pourquoi

Answer 15

AT pcq 2 liens H alors que GC 3 liens

Question 16

comment mesurer hybridation avec un filtre

Answer 16

fixe ADN sur filtre
autre ADN radioactif fait couler sur filtre
si homologie: filtre sera radioactif

Question 17

comment fonctionne le southern blotting

Answer 17

1. ADN recherché est digéré par enzyme de restrictions
2. électrophorèse sur gel
3. dénaturation
4. transféré membrane blotting
5. blotting trempé dans solution ADN marqué (sonde)
6. autoradiographie détecter homologie des deux ADN

Question 18

en quoi consiste la méthode FISH

Answer 18

• fluorescence hybridation in situ
• détecter présence gène ou séquence dans cellule
  1. denaturation
  2. hybridation avec ADN marqué (tag fluorescent)
  3. détection cellule avec fluorescence

Question 19

comment utiliser FISH pour détecter ARN

Answer 19

hybride ARN avec ADN marqué
pas étape dénaturation pcq sinon expose ADN simple brin

Question 20

en quoi consiste utilisation de balises moléculaire pour détecter ADN

Answer 20

environ 30nt bout fluorophore bout quencher

sans ADN deux extrémités sont appariées
avec ADN: voit fluorophore pcq libéré du quencher