cours 2 mcb2399

Question 1

qu’est-ce que le NGS

Answer 1

next generation sequencing

analyse de plusieurs échantillons en même temps dans le même instrument

Question 2

quel sont les 4 techniques de NGS

Answer 2

• pyrosequencing
• illumina
• Nanopore
• PacBio

Question 3

qu’est-ce que le pyrosequencing

Answer 3

pendant la synthèse de ADN, lien entre deux dNTP fait produit: pyrophosphate

APS + pyrophosphate -> ATP
ATP + luciférase -> lumière

lumière est détectée
essai de chaque dNTP et si production de lumière sait que c’est le bon nt

apyrase permet enlever traces des dNTP précédents

Question 4

quel est l’inconvénient du pyrosequencing

Answer 4

• peut seulement faire de courtes séquences (300-500 nt)
• relativement lent pcq pour chaque position: doit faire 4 tests, puis “nettoyage” par apyrase

Question 5

quelles sont les 4 grandes étpaes de Illumina

Answer 5

• préparation ADN
• bridge amplification pour avoir clusters
• séquençage
• analyse

Question 6

en quoi consiste la préparation ADN pour Illumina

Answer 6

• séquence P5 et P7 ajoutés aux extrémités des fragments
• amorces Rd1 et Rd2
• séquence index permet d’analyser différentes échantillons en même temps

Question 7

en quoi consiste l’amplification et clusters pour Illumina

Answer 7

1. ADN se fixé via complémentarité à P5 ou P7
2. ADN forme un pont avec autre extrémité de P5 ou P7
3. formation brin complémentaire
   étapes sont répétées pour former un cluster

Question 8

en quoi consiste l’étape de séquençage chez Illumima

Answer 8

ajout de dNTP marqué avec fluorescence
quand nt marqué est fixé: arrêt élongation: permet identifer le nt
pour continuer élongation: enlever fluorophore

Question 9

que sont des contigs chez Illumina

Answer 9

alignement des séquences lues de 150-500 nt

Question 10

pourquoi faire un read depth avec Illumina

Answer 10

pour être sur d’avoir une bonne séquence sans erreurs
(refaire lecture des même fragments)

Question 11

comment fonctionnne le Nanopore

Answer 11

• petit trou dans une membrane qui sépare deux charges différentes
• ADN traverse un nt à la fois et chaque nt produit un courant différent
• lecture directe sur ADN (pas amplification)

Question 12

avantage et inconvénient de Nanopore

Answer 12

avantage:pas besoin amplification, rapide et longue séquence
inconvénient: +/- précis

Question 13

comment fonctionne PacBio

Answer 13

• ADN pol fixé au puit
• ADN ajouté et dNTP fluorescents
• excitation par laser
• enlever fluorophore pour continuer synthèse

Question 14

avantage et inconvénient de PacBio

Answer 14

• peut faire de très longues séquences
• ADN circularisé par ajout d’adaptateurs permet meilleure précision car plusieurs séquençages du même ADN

inconvénient: plus cher que les autres techniques

Question 15

quel marqueur est utilisé pour l’étude du microbiote bactérien

Answer 15

régions 16S ARN ribosomal car petite taille et peu mutations

Question 16

de quoi est fait ARNr 16S

Answer 16

9 régions variables et 10 constantes
utilisation régions variable V3-V4 pour analyses

Question 17

que permet le séquençage de région V3-V4 du 16S ARNr

Answer 17

infos sur composition et représentation des phylums bactériens

Question 18

quelle est l’autre méthode utilisée autre que 16S ARNr pour analyser microbiote bactérien

Answer 18

shotgun:
analyse ADN au complet

Question 19

quel marqueur est utilisé pour l’étude du microbiote fongique

Answer 19

région ITS2 ARNr
(régions qui peut accumuler mutations/polymorphisme)

Question 20

ecq c’est cher faire du séquençage

Answer 20

devient de moins en moins couteux