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bio mol II > cours 12 mcb2399 > Flashcards

cours 12 mcb2399 Flashcards

1
Q

que permet de voir la microscopie optique

A
  • forme
  • croissance
  • expression génique
  • motilité cellules individuelles
  • structures intracellulaires
  • dynamique intracellulaire
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Q

quelles sont les techniques de microscopie

A
  • optique
  • électronique
  • à force atomique
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3
Q

avantages microscopie optique

A
  • lumière visible
  • cellules vivantes
  • spécifique avec fluorescence
  • résolution quand même faible (250nm), mais super-résolution: 10-50nm
  • 3D pour échantillons épais (confocale)
  • peut mesurer orientation, interactions, identité moléculaire
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4
Q

avantage microscopie électronique

A
  • électron comme longueur onde
  • résolution la plus élevé (0.1 nm)
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5
Q

comment était le premier microscope

A

loupe et lentille: grossissement 300, résolution 1um
par Leeuwenhoek

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6
Q

comment fonctionne le microscope de base à 2 lentilles

A

objectif et occulaire ou lentille de projection

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7
Q

que permet l’ajout d’une lentille de tube

A

espace infini: image se forme à l’infini

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8
Q

avec les microscope réguliers, quel est l’avantage d’utiliser plusieurs lentilles

A
  • contrer aberrations chromatiques (puisque lumière focalise à des points différents)
  • minimiser erreurs de perceptions (artefacts optiques)
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9
Q

différence en champ claire entre illumination critique et Kohler

A

Kohler a une lentille collectrice et un condenseur (pas en critique)
permet de former image à infini pcq rayons sont //

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10
Q

quel est le problème avec le champ clair

A

difficile voir échantillons pcq transparents

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11
Q

comment ecq contraste de phase permet de mieux voir que champ claire

A
  • pcq retarde lumière, permet de transformer les différences de phases en différence intensité
  • ajout plaque de phase et condenseur
  • retardation: ∆x = h* indice de réfraction

indice réfraction: (ncellule - nmilieu)

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12
Q

ecq retardation et différence de phase même chose

A

oui?

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12
Q

qu’est ce que le SLIM

A
  • spatial light interference microscopy
  • permet de mesurer la retardation
  • variant de contraste de phase
  • permet déduire masse sèche
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13
Q

comment ecq SLIM permet de déduire la masse sèche

A

indice de réfraction proportionnel à densité masse des solutés

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14
Q

que permet holotomographie

A

reconstruction 3D
prise images de plusieurs côtés

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15
Q

qu’est-ce que la photométrie de masse

A

mesure masse molécule unique en temps réelle

microscope réflexion: dèes 1 molécule se lie, change réfléxion lumière à surface

16
Q

caractéristiques epi-fluorescence

A
  • filtre excitation et émission
  • miroir dichroique
17
Q

quelles sont les caractéristiques importantes de la fluorescence

A
  • longueur onde maximale excitation et émission
  • coefficient absportion molaire/extinction: capacité d’une molécule à être excité
  • rendement quantique: nombre photons excitation produisant fluorescence
  • éclat: coefficient absorption * rendemen quantique/ 1000
  • photoblanchiment: perte fluorescence à cause ROS
  • poids moléculaire
18
Q

caractéristiques fluorescine

A
  • protonation (bas pH): réduit fluorescence
  • rigidité symétrie permet rendement quantique élevé
19
Q

comment coefficient extinction change selon longueur onde

A

augmentation longueur onde: augmentation coefficient

20
Q

relation entre éclat et longueur onde

A

augmentation longueur onde, augmente coefficient, augmente éclat

21
Q

comment ajouter des colorants fluorescents aux biomolécules

A
  • protéines: a.a nucléophiles: substitue avec groupes électrophile
  • amines
22
Q

exemples de colorants labelisant d’autres molécules

A

fluorogène: s’allule seulement quand lié
- DAPI: colore ADN
- colorant lipophilique colorant membrane

23
Q

comment utilisé des dyes fluorescents

A

avec tags, peptides ou protéines qui sont ciblés par dyes

23
Q

que permettent les colorants labelisant la paroi peptidoglycane

A
  • combinaison de plusieurs colorants pour time lapse de synthèse paroi
  • D-ala marqué quand ajoute dans synthèse: permet voir
  • avec coumarin, TMR, NBD-F)
24
Q

caractéristique GFP

A
  • provient méduse
  • 3 a.a au centre tonneau beta: thréonine, tyrosine, glycine
  • possible de changer les a.a pour changer caractéristiques fluorogéniques
  • besoin de maturation: va prendre du temps avant de le voir
  • photoblanchiment (10x plus vites que fluorophores organiques)
25
Q

comment se fait la maturation de la GFP

A
  1. rotation a.a.
  2. cyclisation entre thr et glycine
  3. oxydation tyrosine par oxygène moléculaire

étape 3: étape limitante (5-60min)

26
Q

exemple de sonde moléculaire

A

Queen-m2: mesure concentration ATP dans cellule
- GFP lié à une ATPase
- selon si lié ou non à ATP: change le spectre excitation (pas émission)

PHluorin (pH), HyPer (ROS), GCamMP (calcium)

27
Q

caractéristiques FRET

A
  • transfert énergie non-radiatif entre donneur et accepteur
  • besoin overlap entre spectre donneur et accepteur
  • efficacité selon distance R entre 3 et 7nm
28
Q

quelle est la limite de la microscopie a épi- fluorescence

A

diffraction: image apparait flou si distance trop petite que:
d = 0.6longueur onde/NA

c’est la limite de résolution

limité à direction Z

29
Q

qu’est-ce que la NA

A

ouverture numérique de objectif
- selon la distance travail

30
Q

la limite de résolution est indépendante de quoi

A

grossissement objectif

31
Q

comment résoudre le problème de signal de fond

A
  • utilisation TIRFM: laser avec grand angle, fait reflété complètement, capable de voir jusqu’à hauteur de 200nm (peut juste voir ce qui est proche de la lamelle), besoin laser
  • confocale à balayage laser: lumière excitation focalisé sur un point, seulement lumière émise détectée (grâce pinhole), balayage à travers échantillon permet visualiser 3D
32
Q

avantages et désavantage microscope confocale balayage laser

A

+: réduction signal de fond, meilleur résolution
-: réduit signal (perte photons), photoblanchiment par forte illumination

33
Q

qu’est-ce que la super-résolution

A
  • permet voir structure intracellulaire de bactéries
    STED:
    1. laser excitation
    2. laser dépletion forme beigne (éliminer molécules qui ne se trouve pas directement dans point du laser excitation)
    3. résolution théorie 0, mais 20-50nm

bio mol II (12 decks)

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