cours 12 mcb2399 Flashcards
que permet de voir la microscopie optique
- forme
- croissance
- expression génique
- motilité cellules individuelles
- structures intracellulaires
- dynamique intracellulaire
quelles sont les techniques de microscopie
- optique
- électronique
- à force atomique
avantages microscopie optique
- lumière visible
- cellules vivantes
- spécifique avec fluorescence
- résolution quand même faible (250nm), mais super-résolution: 10-50nm
- 3D pour échantillons épais (confocale)
- peut mesurer orientation, interactions, identité moléculaire
avantage microscopie électronique
- électron comme longueur onde
- résolution la plus élevé (0.1 nm)
comment était le premier microscope
loupe et lentille: grossissement 300, résolution 1um
par Leeuwenhoek
comment fonctionne le microscope de base à 2 lentilles
objectif et occulaire ou lentille de projection
que permet l’ajout d’une lentille de tube
espace infini: image se forme à l’infini
avec les microscope réguliers, quel est l’avantage d’utiliser plusieurs lentilles
- contrer aberrations chromatiques (puisque lumière focalise à des points différents)
- minimiser erreurs de perceptions (artefacts optiques)
différence en champ claire entre illumination critique et Kohler
Kohler a une lentille collectrice et un condenseur (pas en critique)
permet de former image à infini pcq rayons sont //
quel est le problème avec le champ clair
difficile voir échantillons pcq transparents
comment ecq contraste de phase permet de mieux voir que champ claire
- pcq retarde lumière, permet de transformer les différences de phases en différence intensité
- ajout plaque de phase et condenseur
- retardation: ∆x = h* indice de réfraction
indice réfraction: (ncellule - nmilieu)
ecq retardation et différence de phase même chose
oui?
qu’est ce que le SLIM
- spatial light interference microscopy
- permet de mesurer la retardation
- variant de contraste de phase
- permet déduire masse sèche
comment ecq SLIM permet de déduire la masse sèche
indice de réfraction proportionnel à densité masse des solutés
que permet holotomographie
reconstruction 3D
prise images de plusieurs côtés
qu’est-ce que la photométrie de masse
mesure masse molécule unique en temps réelle
microscope réflexion: dèes 1 molécule se lie, change réfléxion lumière à surface
caractéristiques epi-fluorescence
- filtre excitation et émission
- miroir dichroique
quelles sont les caractéristiques importantes de la fluorescence
- longueur onde maximale excitation et émission
- coefficient absportion molaire/extinction: capacité d’une molécule à être excité
- rendement quantique: nombre photons excitation produisant fluorescence
- éclat: coefficient absorption * rendemen quantique/ 1000
- photoblanchiment: perte fluorescence à cause ROS
- poids moléculaire
caractéristiques fluorescine
- protonation (bas pH): réduit fluorescence
- rigidité symétrie permet rendement quantique élevé
comment coefficient extinction change selon longueur onde
augmentation longueur onde: augmentation coefficient
relation entre éclat et longueur onde
augmentation longueur onde, augmente coefficient, augmente éclat
comment ajouter des colorants fluorescents aux biomolécules
- protéines: a.a nucléophiles: substitue avec groupes électrophile
- amines
exemples de colorants labelisant d’autres molécules
fluorogène: s’allule seulement quand lié
- DAPI: colore ADN
- colorant lipophilique colorant membrane
comment utilisé des dyes fluorescents
avec tags, peptides ou protéines qui sont ciblés par dyes
que permettent les colorants labelisant la paroi peptidoglycane
- combinaison de plusieurs colorants pour time lapse de synthèse paroi
- D-ala marqué quand ajoute dans synthèse: permet voir
- avec coumarin, TMR, NBD-F)
caractéristique GFP
- provient méduse
- 3 a.a au centre tonneau beta: thréonine, tyrosine, glycine
- possible de changer les a.a pour changer caractéristiques fluorogéniques
- besoin de maturation: va prendre du temps avant de le voir
- photoblanchiment (10x plus vites que fluorophores organiques)
comment se fait la maturation de la GFP
- rotation a.a.
- cyclisation entre thr et glycine
- oxydation tyrosine par oxygène moléculaire
étape 3: étape limitante (5-60min)
exemple de sonde moléculaire
Queen-m2: mesure concentration ATP dans cellule
- GFP lié à une ATPase
- selon si lié ou non à ATP: change le spectre excitation (pas émission)
PHluorin (pH), HyPer (ROS), GCamMP (calcium)
caractéristiques FRET
- transfert énergie non-radiatif entre donneur et accepteur
- besoin overlap entre spectre donneur et accepteur
- efficacité selon distance R entre 3 et 7nm
quelle est la limite de la microscopie a épi- fluorescence
diffraction: image apparait flou si distance trop petite que:
d = 0.6longueur onde/NA
c’est la limite de résolution
limité à direction Z
qu’est-ce que la NA
ouverture numérique de objectif
- selon la distance travail
la limite de résolution est indépendante de quoi
grossissement objectif
comment résoudre le problème de signal de fond
- utilisation TIRFM: laser avec grand angle, fait reflété complètement, capable de voir jusqu’à hauteur de 200nm (peut juste voir ce qui est proche de la lamelle), besoin laser
- confocale à balayage laser: lumière excitation focalisé sur un point, seulement lumière émise détectée (grâce pinhole), balayage à travers échantillon permet visualiser 3D
avantages et désavantage microscope confocale balayage laser
+: réduction signal de fond, meilleur résolution
-: réduit signal (perte photons), photoblanchiment par forte illumination
qu’est-ce que la super-résolution
- permet voir structure intracellulaire de bactéries
STED:
1. laser excitation
2. laser dépletion forme beigne (éliminer molécules qui ne se trouve pas directement dans point du laser excitation)
3. résolution théorie 0, mais 20-50nm
