cours 4 mcb2399 Flashcards
caractéristiques PCR
- amplifier segment spécifique ADN ou ARN à partir amorces
- amorces 15 à 25 nt
- rapide
- produit grande quantité
quelle étape est nécessaire pour amplification par PCR avec ARN
ARN en ADN par RT reverse transcriptase
quel est le contenu général d’un mélange réactionnel pour PCR
ADN
amorces
dNTP
Tap pol
quels sont les liens entre les nt des 2 brins d’ADN
liens H (liens faibles)
qu’est-ce que le Tm
température fusion moléculaire à laquelle 50% molécules sont hybridées-séparées
spécifique à chaque séquence ADN
que doit-on faire pour améliorer la spécificité d’un PCR
augmente longeur des amorces
pourquoi est-ce important de tenir compte des Tm des deux amorces
- chaque amorce a son Tm: besoin d’un max de 5 degré de différence
- si mauvaise température: peut avoir mismatch: amorce va s’hybrider à un endroit pas 100% homologue
à quoi ç sert de mettre un excès d’amorces
plus de chances hybridation amorce-ADN et empêche ADN de s’hybrider avec lui-même
un PCR augmente de quelle façon quand on fait plusieurs cycle
exponentielle (2^x)
quand on fait un PCR est-ce vraiment une progression exponentielle
non fait un plateau
- réactifs épuisés
- polymérase endommagée
quelles sont les applications du PCR
- recherche
- médecine légale
- diagnostic maladies héréditaires
- détection cancer
- classification organismes
- détection pathogènes
qu’est-ce qu’un PCR niché
2 amplifications
1. avec amorces externes: en dehors de la séq recherchée
2. amorces internes
avantages et inconvénients du PCR niché
+: augmentation sensibilité et spécificité
-: risque contaminations et faux positifs
ecq les humains ont des ADN différents
identique à 99% 1% qui varie d’un individu à l’autre
comment le PCR est utilisé en médecine légale
pour différencier individu: cible région ADN qui varie (le 1%)
source: peau, sang, cheveu, salive
qu’est-ce qu’un STR
short tandem repeat (dans un allèle)
comment fonctionne le séquençage de Sanger
PCR utilisant nt fluorescents
séquençage par électrophorèse capillaire pour détecter fluorescence
les arbres phylogénétiques de bactéries sont basés sur quoi/identifié à l’aide de quoi
ARNr 16S
(parties conservées et parties variables)
dans la mutagénèse dirigée quel est le but d’utiliser des amorces plus longues
plus de chances d’hybridation même avec une mutation
que permet le PCR en temps réel
- quantifier expression d’un gène
- vérifiier la présence de SNP (mutations)
- déterminer présence agents viraux, pathogène, parasitaire etc
différence PCR classique et PCR en temps réel
classique: permet de dire si j’ai le gène ou pas
temps réel: permet de dire si j’en ai ou pas mais aussi combien (quantifier)
quelles sont les méthodes de PCR en temps réel
- agent se liant à ADN double brin
- balise moléculaires
- hydrolyse de sondes
comment fonctionne PCR en temps réel et qu’est-ce qu’un graphique montre
fait plusieurs cycles d’amplifications et à chaque cycle: détection fluorescence
graphique possède Ct: cycle threshold: nombre de cycles nécessaire pour avoir fluorescence plus grande que bruit de fond
permet déterminer quantité: besoin moins de cycle pour arriver au Ct veut dire plus grande concentration, si bcp bcp de cycles: faible concentration
en quoi consiste la méthode de PCR en temps réel de l’agent se liant à ADN double brin
utilisation SYBR green
1. ADN db dénaturé
2. pendant hybridation: SYBR se lie sur ADN db et émet fluorescence
3. pendant élongation: plusieurs SYBR de liés: bcp de fluorescence
fluorescence mesuré à chaque cycle élongation
quel est l’inconvénient et avantage de la méthode agent se liant à ADN double brin du PCR en temps réel
moins sensibles et spécifique mais bcp moins cher
en quoi consiste les balises moléculaire dans le PCR en temps réel
5’: fluorophore qu’on va voir
3’: quencher
ajout sonde qui se fixe entre les deux amorces
quand hybridiation: fluorescence apparait et détectée
comment fonctionne la méthode d’hydrolyse de sonde avec le PCR en temps réel
utilisation Taq Pol (TaqMan), sonde spécifique et fluorophore/quencher
- sonde s’accroche entre 2 amorces
- sonde hydrolysée(mange) par TaqMan
- libération fluorophore
fluorescence apparait et détectée pendant hydrolyse de la sonde
niveau de fluorescence élevé et facilement détectable
