Cours 6 Flashcards
Quels sont les deux restrictions que la cellule présentant un CMH doit remplir pour qu’elle soit reconnu par un le TCR ?
1 : Doit avoir un CMH du soi
2 : Doit avec le peptide spécifique au TCR
Quelles sont les deux modèles qui expliquent la reconnaissance de l’Ag et du CMH du soi ?
1 : Deux récepteurs séparés, l’un reconnaissant le CMH et l’autre reconnaissant l’antigène
2 : Une seul récepteur, capable de reconnaître l’Ag complexé avec une molécule du CMH du soi
Lequel des deux modèles (deux récepteurs ou un seul récepteur) s’est avéré vrai ?
Un seul récepteur
Qu’est-ce que le RCT (TCR) ?
Récepteur spécifique des cellules T qui permet la reconnaissance de l’Ag en association avec le CMH du soi (classe I ou classe II)
Quelles sont les difficultés rencontrés qui ont rendu l’identification plus tardive du RCT (TCR) ?
1 : Les cellules T devaient posséder un récepteur Ag spécifique et clonotypique (différent d’une cellule T à une autre)
2 : Identification tardive par rapport aux Ac
3 : Récepteur membranaire (pas de forme soluble)
4 : Interaction plus faible avec l’Ag que les Ac
5 : Spécifique pour l’Ag et le CMH
Comment est-ce que l’on a fait pour identifier/isoler le TCR ? (3)
1 : Une cellule T spécifique pour l’Ag OVA aura un TCR différent qu’une cellule T spécifique pour le KLH; ceci est attendu afin que le TCR puisse intéragir avec le complexe peptide antigénique-CMH de façon spécifique
2 : Chaque cellule T porte un TCR de séquence différente
3 : On devrait donc pouvoir produire des Ac reconnaissant le TCR et utiliser ces Ac pour caractériser biochimiquement le TCR
Comment faire la culture des lymphocytes T spécifique pour un Ag ? Ex. OVA (3)
1 : Immunisation de la souris par un Ag afin de faire proliférer les cellules T réactives envers l’Ag OVA
2 : Récolte des ganglions 7 jours plus tard
3 : Expansion des LT in vitro en les cultivant avec l’Ag (fera proliférer les LT contre OVA, mais pas les autres)
Comment est-ce que l’on produit un hybridome T spécifique à un Ag donné ? (2)
1 : Fusion des cellules T spécifiques à l’Ag, avec une lignée de cellule T cancéreuse
2 : Clonage par dilution limite afin d’avoir un hybridome qui possède une séquence unique de TCR permettant de reconnaître l’Ag OVA
Quelles sont les étapes de l’expérience qui a permis d’isoler le TCR ? (8)
1 : Formation d’un hybridome T Ag spécifique
2 : Ajout de polyéthylène glycol pour induire la fusion de Ag spécifique T et une ligné cellulaire immortelle
3 : Dilution des cellules fusionné dans des puits pour que chacun aie une seule cellule. Cela permet aux cellules de se diviser et tester leur abilité de sécréter IL-2 en présence de l’Ag
4 : Production d’Ac qui vont pouvoir lier le TCR
5 : Fusionner les LB qui produisent des Ac spécifique au TCR avec des cellules immortelles
6 : Sélection et amplification des clones qui sécrètent des Ac qui se fixent aux hybridomes T
7 : Identification d’un Ac qui lie le TCR en déterminant si l’ajout de l’AC inhibe la reconnaissance Ag et donc l’activation de l’hybridome T (Pas d’IL2)
8 : Utilisation de l’Ac monoclonal pour immunoprécipiter le TCR et démontrer qu’il est composé de deux chapines d’environ 45kDa
De quoi est formé le TCR ?
D’une chaîne alpha et beta
Quelles sont les caractéristiques du TCR ?
1 : Membre de la superfamille des immunoglobulines
2 : Chaque chaîne possède 2 domaines de 60-75 aa contenant chacun un pont di-s intrachaîne
3 : Nter Variation marquée de la séquence d’un TCR à un autre : domaine variable dans V; régions hypervariables dans V
4 : Proximal à la membrane, domaine constant ou C
5 : Région transmembranaire de 21-22 aa contiennent des résidus chargés positivement, inhabituel pour un domaine membranaire
6: Courte queue cytoplasmique en C ter
Comment est-ce qu’il est possible d’avoir autant de TCR différents ?
À cause du réarrangement du TCR : juxtaposition aléatoire des segments VDJ permet d’obtenir un grand nombre de TCR différent
Quels segments possède la chaîne alpha ?
V-J
Quels segments possède la chaîne beta ?
VDJ
Qu’est-ce que les SSR ( séquence signal de recombinaison) ?
Les SSR sont des séquences nucléotidiques qui dictent quels segments peuvent être réarrangés. Ils assurent que les réarrangements se feront seulement avec les segments de gène du RCT et non avec d’autres gènes et ils assurent que les bons segments sont réarrangés ensemble (V-J pour la chaine alpha et V-D-J pour la chaine beta). De plus, ils assurent qu’il n’y a pas de réarrangement V-V ou J-J…
De quoi sont constitué les SSR ? (2)
1 : D’un heptamère et d’un nonamère dont la séquence nucléotidique est conservé dans tous les SSR
2 : D’un espaceur de 12 ou 23 pb dont la séquence est moins conservée
Pourquoi les espaceurs des SSR font 12 ou 23 paires de bases ?
Afin de positionner les RSS du même côté de la double hélice d’ADN afin de les rendre accessible à une même enzyme
Sur la chaîne alpha du TCR, où se situent les SSR à 12 et 23 pb ?
Sur le segment V 23 pb de 5’ à 3’
Sur le segment J 12 pb de 3’ à 5’
Sur la chaîne beta du TCR, où se situent les SSR à 12 et 23 pb ?
Sur le segment V 23 pb de 5’ 3’
Sur le segment D 12 pb de 3’ 5’
Sur le segment D 23 pb de 5’ 3’
Sur le segment J 12 pb de 3’ 5’
Lesquels dans Rag1, Rag2, TdT. Artemis et ADN ligase 4 sont spécifique aux lymphocytes ?
Rage 1/2 et TdT
Caractéristiques de Rag 1/2. (2)
Notez que Rag1 et Rag2 fonctionnent ensemble, l’absence de une des deux protéines empêche la recombinaison (ou réarrangement). Les gènes codant pour Rag1 et Rag2 sont seulement distants de 8 kb sur l’ADN génomique
Rag1 et 2 sont indispensables à la recombinaison VDJ. Ils sont exprimés seulement pendant le développement des lymphocytes afin que le réarrangement (recombinaison) ait lieu seulement dans les cellules lymphoïdes.
Explique la première étape de la recombinaison VDJ : synapse.
RAG1/2 se lient au SSR. Ensuite Rag1/2 catalysent la formation de la synapse entre le segment de gène V et J. Ceci permet de rapprocher les deux segments de gènes qui sont distants dans le locus .Les protéines HMG permettent d’aider le repliement de l’ADN afin de rapprocher les segments de gène.
Explique la deuxième étape de la recombinaison VDJ : clivage.
Rag1/2 introduisent une cassure simple brin dans un des brins d’ADN exactement en 5’ de l’heptamère du SSR des segments de gène V et J.
Explique la troisième étape de la recombinaison VDJ : transestérification.
Le groupement 3’OH généré par le clivage de Rag1/2 va attaquer le groupement phosphate de l’autre brin d’ADN (trans-estérification) créant une extrémité en épingle au niveau de l’extrémité codante et une extrémité franche au niveau du bout signal
Explique la quatrième étape de la recombinaison VDJ : ouverture de l’épingle par Artemis
Notez que cette ouverture peut avoir lieu à différent endroit dans l’épingle. Selon l’endroit où l’ouverture sera faite cela créera différentes extrémités (cohésives en 5’ ou 3’ ou franches).
Explique la cinquième étape de la recombinaison VDJ : ajout des P-nucléotides
Les extrémités cohésives sont remplies par une polymérase en utilisant l’information du brin complémentaire (nucléotides palindromiques, même séquence sur les deux brins)
Explique la sixième étape de la recombinaison VDJ : action des exonucléases
À l’occasion avant que les extrémités soient remplies par la polymérase, il arrive que des exonucléases enlèvent des nucléotides.
Explique la septième étape de la recombinaison VDJ : ajout de N-nucléotides par Tdt.
(a lieu aussi bien pour la chaine alpha et beta). Avant la ligation des extrémités codantes pour former la jonction codante, il y aura ajout de nucléotides de façon aléatoire et indépendante de la matrice d’ADN par l’enzyme Tdt (terminal deoxy transferase)
Explique la huitième étape de la recombinaison VDJ : ligation
Ligation des extrémités pour former la jonction codante. Utilises les enzymes classiques de la réparation des cassures d’ADN double brin
Quelle étape de la recombinaison VDJ augmente de façon très importante la diversité de séquence du TCR ?
Ajout de N-nucléotides
