Cours 1 - Diagnostique Moleculaire Flashcards
Principe de la PCR ? T’as besoin de quoi ?
Augmenter exponentiellement quantité d’ADN
Polymerase - Amorces 5´3’ et 3’5’ (10 a 20 pb)
C’est quoi le facteur d’amplification dans une PCR ?
2^ nombre de cycle
C’est quoi les étapes d’une PCR ?
Denaturation 95 degres
Hybridation 50 degres
Elongation 72 degres
Repeattt
Est ce que la PCR amplifie aussi les contaminants ?
Ouii
Quelle est la différence entre une PCR simple et une PCR nichée ? En quoi consiste t elle ?
On réalise deux cycles PCR successifs pour être plus spécifiques et sensibles
Amorces externes et internes
Utile si quantité ADN faible, difficile à amplifier ou contaminé par des sequences non specifiques
Explique les points essentiels de RT PCR
A partir d’ARN
Digestion de tout l’ADN génomique du spécimen (eviter d’amplifier des trucs qu’on veut pas)
Creation de ADNc a partir de mARN via transcriptase inverse
Comment est l’ADN produit par PCR apres une RT PCR
ADNc donc codant et SANS introns
Donne des infos uniquement sur les genes transcrits
Quelques points sur les enzymes de restriction ?
Reconnait séquence tres precise (4 a 12pb) plus la sequence est longue moins y’a de coupure
Coupe uniquement cette sequence
si par exemple y’a 1000 cellules et on met une enzyme de restriction pour avoir la séquence ACTG combien y’en aura t il ?
1000 fragments identiques après digestion ( si cette séquence n’existe qu’une fois)
Quels sont les deux types de diagnostic moleculaire ?
ADN ou ARN
Quels sont les test basés sur l’ADN ? L’ARN ?
ADN : southern, PCR, FISH, SNP
ARN : Nothern, RT-PCR, puce ARN, western buvardage
Les 5 etapes avec qql détails cles de la methode du Southern Blot ?
- Extraction ADN : besoin de bcp d’ADN purifié
- Digestion enzymatique : pleins de petits fragments ADN
- Electrophorese sur gel agarose : migration en fonction du poids - vers + et les plus petits sont en bas
Plus le gel est dense plus c’est facile de séparer des fragments qui se ressemblent - Transfert sur mb nitrocellulose
- Hybridation : sonde d’adn marquée (ex radioactive) (complémentaire au gene recherche) qu’on place en solution avec la mb dans un tube d’hybridation rotatif puis lavage
- Revelation sur film radiographique
2 gros avantages du Southern ?
Infos quantitatives et qualitatives sur les genes cibles
Detection ADN au sein d’un melange complexe
3 inconvénients Southern ?
Tres long
Nécessite énormément d’ADN
Cher et bcp de manip
Principe d’hybridation ? Lors du southern
Denaturation
Ajout de la sonde marquee
Renaturation
Difference entre stringence et permissivite ?
Une réaction et stringentr lorsqu’elle est faite avec des paramètres de température, qui empêche une hybridation à moins qu’il y ait à appariement parfait entre la sonde et l’ADN génomique. (Technique des asos ou on cherche la temperature ou deux brins d’ADN parfaitement homologue vont se dénaturer)
En revanche, une réaction permissive, c’est lorsque la son peut s’apparier, même si l’homologie n’est pas parfaite
5 éléments que le Southern blot peut nous permettre de détecter ?
- Détecter la présence de micro-organismes dans un échantillon
2.détecter les allèle muté de poids poids, moléculaire, différent de l’allèle normal (RFLP)
- Évalue la quantité d’ADN dans les échantillons. Exemple cancer, gene N–MYC.
- Détecter des allèles muté, quand la mutation, inclut ou supprimer un site de restrictions
- Detection des mutations ponctuels
Explique le concept général du RFLP ?
Permet d’analyser des variations génétiques en coupant l’ADN avec des enzymes de restriction ses enzymes, reconnaissent des séquences spécifiques et clivent l’ADN. À ce site. Une mutation dans un site de restriction en train des fragments d’ADN de longueur différentes après digestion. Le FLP est utilisé pour détecter des mutations génétiques, réaliser des tests de parenté et dans les empreintes génétiques pour la médecine légal. C’est une méthode spécifique mais plus long et moins sensible que les techniques modernes comme la PCR.
Spécifiquement d’apres le cours c’est quoi le but du RFLP ?
Différencier les allèles d’un gène qui nous intéresse. Intéresse
Ex : diagnostic prenatal
Ex : incriminer un suspect
Ex : test de paternité
Quels sont les deux raisons qui expliquent les différences de taille entre les fragments de restriction ?
- Portions incluse entre les sites de restrictions peut contenir des séquences répétées. (Souvent des regions non codantes Alu SINE LINE S)
- La différence d’un nucléotides peut générer ou oblitérer un site de restrictions occasionnant un fragment plus court au plus long long.
Est ce que les RFLP peuvent être mis en évidence par PCR ?
Ouii
Quand est ce qu’il est preferable d’utiliser un dot blot plutot qu’un southern blot ?
Lorsque la taille du fragment détecte n’est pas important et qu’il faut une reponse oui/non rapidement
(Utilise ASO)
Avantage du dot blot sur southern blot ?
Beaucoup plus rapide,
pas de digestion,
pas d’électrophorèse,
pas de transfert
beaucoup plus d’échantillons
C’est quoi le Nothern blot ?
Mm chose que Southern blot mais ici on étudie l’ARNm et pas l’ADN
Aussi pas besoin de digestion
Etudie les genes spécifiquement quels genes vont etre transcrits dans quel tissus et a quel moment par exemple
