Cours 1 - Diagnostique Moleculaire Flashcards
Principe de la PCR ? T’as besoin de quoi ?
Augmenter exponentiellement quantité d’ADN
Polymerase - Amorces 5´3’ et 3’5’ (10 a 20 pb)
C’est quoi le facteur d’amplification dans une PCR ?
2^ nombre de cycle
C’est quoi les étapes d’une PCR ?
Denaturation 95 degres
Hybridation 50 degres
Elongation 72 degres
Repeattt
Est ce que la PCR amplifie aussi les contaminants ?
Ouii
Quelle est la différence entre une PCR simple et une PCR nichée ? En quoi consiste t elle ?
On réalise deux cycles PCR successifs pour être plus spécifiques et sensibles
Amorces externes et internes
Utile si quantité ADN faible, difficile à amplifier ou contaminé par des sequences non specifiques
Explique les points essentiels de RT PCR
A partir d’ARN
Digestion de tout l’ADN génomique du spécimen (eviter d’amplifier des trucs qu’on veut pas)
Creation de ADNc a partir de mARN via transcriptase inverse
Comment est l’ADN produit par PCR apres une RT PCR
ADNc donc codant et SANS introns
Donne des infos uniquement sur les genes transcrits
Quelques points sur les enzymes de restriction ?
Reconnait séquence tres precise (4 a 12pb) plus la sequence est longue moins y’a de coupure
Coupe uniquement cette sequence
si par exemple y’a 1000 cellules et on met une enzyme de restriction pour avoir la séquence ACTG combien y’en aura t il ?
1000 fragments identiques après digestion ( si cette séquence n’existe qu’une fois)
Quels sont les deux types de diagnostic moleculaire ?
ADN ou ARN
Quels sont les test basés sur l’ADN ? L’ARN ?
ADN : southern, PCR, FISH, SNP
ARN : Nothern, RT-PCR, puce ARN, western buvardage
Les 5 etapes avec qql détails cles de la methode du Southern Blot ?
- Extraction ADN : besoin de bcp d’ADN purifié
- Digestion enzymatique : pleins de petits fragments ADN
- Electrophorese sur gel agarose : migration en fonction du poids - vers + et les plus petits sont en bas
Plus le gel est dense plus c’est facile de séparer des fragments qui se ressemblent - Transfert sur mb nitrocellulose
- Hybridation : sonde d’adn marquée (ex radioactive) (complémentaire au gene recherche) qu’on place en solution avec la mb dans un tube d’hybridation rotatif puis lavage
- Revelation sur film radiographique
2 gros avantages du Southern ?
Infos quantitatives et qualitatives sur les genes cibles
Detection ADN au sein d’un melange complexe
3 inconvénients Southern ?
Tres long
Nécessite énormément d’ADN
Cher et bcp de manip
Principe d’hybridation ? Lors du southern
Denaturation
Ajout de la sonde marquee
Renaturation
Difference entre stringence et permissivite ?
Une réaction et stringentr lorsqu’elle est faite avec des paramètres de température, qui empêche une hybridation à moins qu’il y ait à appariement parfait entre la sonde et l’ADN génomique. (Technique des asos ou on cherche la temperature ou deux brins d’ADN parfaitement homologue vont se dénaturer)
En revanche, une réaction permissive, c’est lorsque la son peut s’apparier, même si l’homologie n’est pas parfaite
5 éléments que le Southern blot peut nous permettre de détecter ?
- Détecter la présence de micro-organismes dans un échantillon
2.détecter les allèle muté de poids poids, moléculaire, différent de l’allèle normal (RFLP)
- Évalue la quantité d’ADN dans les échantillons. Exemple cancer, gene N–MYC.
- Détecter des allèles muté, quand la mutation, inclut ou supprimer un site de restrictions
- Detection des mutations ponctuels
Explique le concept général du RFLP ?
Permet d’analyser des variations génétiques en coupant l’ADN avec des enzymes de restriction ses enzymes, reconnaissent des séquences spécifiques et clivent l’ADN. À ce site. Une mutation dans un site de restriction en train des fragments d’ADN de longueur différentes après digestion. Le FLP est utilisé pour détecter des mutations génétiques, réaliser des tests de parenté et dans les empreintes génétiques pour la médecine légal. C’est une méthode spécifique mais plus long et moins sensible que les techniques modernes comme la PCR.
Spécifiquement d’apres le cours c’est quoi le but du RFLP ?
Différencier les allèles d’un gène qui nous intéresse. Intéresse
Ex : diagnostic prenatal
Ex : incriminer un suspect
Ex : test de paternité
Quels sont les deux raisons qui expliquent les différences de taille entre les fragments de restriction ?
- Portions incluse entre les sites de restrictions peut contenir des séquences répétées. (Souvent des regions non codantes Alu SINE LINE S)
- La différence d’un nucléotides peut générer ou oblitérer un site de restrictions occasionnant un fragment plus court au plus long long.
Est ce que les RFLP peuvent être mis en évidence par PCR ?
Ouii
Quand est ce qu’il est preferable d’utiliser un dot blot plutot qu’un southern blot ?
Lorsque la taille du fragment détecte n’est pas important et qu’il faut une reponse oui/non rapidement
(Utilise ASO)
Avantage du dot blot sur southern blot ?
Beaucoup plus rapide,
pas de digestion,
pas d’électrophorèse,
pas de transfert
beaucoup plus d’échantillons
C’est quoi le Nothern blot ?
Mm chose que Southern blot mais ici on étudie l’ARNm et pas l’ADN
Aussi pas besoin de digestion
Etudie les genes spécifiquement quels genes vont etre transcrits dans quel tissus et a quel moment par exemple
Principe du westernblot ?
Tu coco deja
Que permet aussi le westernblot en plus d’etudier les prot ?
Mets facilement en évidence des mutations occasionnant des polymorphismes dans les allèles ou des délétion des 2 allèles
Avantage de la pcr ? 3
Rapide
Peu adn
96 test a la fois
Petit inconvénient pcr ?
Besoin de connaître les amorces et donc le gene
Amplifie que les petites séquences
Quelles sont les techniques utilisées pour visualiser les chromosomes ? 4 principales et 2 biz
Caryotype
FISH
CGH
SNP
Puce ddx clinique
Puce combine CGH-SNP
A quoi sert la methode FISH ?
Visualiser et localiser des séquences specifiques d’ADN direct dans les cellules ou tissus en utilisant des sondes marquées
En gros permet d’identifier la présence, l’absence ou les réarrangement de séquences génétique sur des chromosomes
Les trois types de sondes dans FISH et a quoi elle servent ?
Sonde centromerique : reconnaît les régions centromère des chromosomes utilisées pour détecter les anomalies chromosomiques comme les trisomie
Sonde spécifique de locus : cible, une région spécifique d’un chromosome utilisé pour détecter des ions duplication ou ou réarrangement des genes
Sonde de fusion et de séparation : utiliser pour détecter des translocation chromosomique ou deux segments de chromosomes, se fusionnent où se séparent
Explique fonctionnement sonde de separation ? Souvent utilisé pour quoi ?
Se mettent autour d’un gene une sonde verte + rouge = signal jaune
Si translocation d’un gene alors signal jaune disparaît et signal anormal vert + rouge
Etudier les oncogenes qui ont de partenaires de fusion
Explique fonctionnement sonde de fusion ?
On met une sonde de couleur diff sur 2 gènes différents = 2 signaux verts 2 signaux rouges (2 alleles)
Si fusion alors on aura un signal anormal jaune sur l’un des kr
Qu’est ce qui determine si on choisit une sonde de fusion ou séparation ?
Séparation uniquement si on veut savoir si y’a un réarrangement des Kr mais qu’on s’en fiche de savoir le gene partenaire de son réarrangement
Sinon on prendrait fusion
Diff entre Fish et fish semi quantitatif ?
Permet aussi d’avoir une estimation du nb de copie de la sequence d’interet
On peut compter le nb de signaux fluorescents dans chaque cellule
Ex : dans le cancer du sein avec HER2/neu ou trisomie 21
C’est quoi la methode SKY ?
Fish spectral : meme principe sauf que la on va visualiser l’ensemble des Kr donc on va créer des combinaisons de sondes (peinture chromosomique) qui vont identifier spécifiquement chacun des Kr
On pourra voir si y’a anomalies translocations ect…
Quels sont les trois catégories de translocation oncogenique ? Detecable par quoi ?
- Celle qui delete un gene supresseur de tumeur
- Celle qui couple un promoteur actif avec un porto-oncogene inactif
- Celle qui forme des protéines chimériques
Southern et FISH aussi RT-PCR mais pas PCR simple
Avantage du CGH sur caryotype ?
100 sondes par gene donc sensibilité 10 000 fois supérieur au caryotype !
Elle detecte précisément les exons deletes
Comment fonctionne CGH ?
Puce contenant 2Millions de sondes cartographiant bcp de genes
Tu melanges ADN génomique du patient plus celui de ton temoin (rouge et vert)
Tu drop une goutte sur chacun des puits
Si jaune = ok
Vert = amplification du gene patient
Rouge = deletion chez le patient
Comment étudier l’expression d’un gene dans une population de cellules avec une micropuce ?
On prend l’ARN on faire RT-PCR on a ADNc et on mesure le niveau d’intensité du signal fluorescent sur la plaque selon le gene
Comment fonctionne les puces pour les SNP ?
600K sondes pour 300K loci donc 2 sondes par locus
2 Allèles sont etudies pour chaque locus
Donc chaque locus peut etre AA AB ou BB
Ici on parle de polymorphisme au niveau d’un seul nucleotide
Que signifie la ligne rouge dans un diagramme d’un SNP ?
La quantité d’adn qui si = 0 = diploide (cas dans un porteur sain (pas tjrs))
Que signifie une absence de signal dans un diagramme de SNP ?
Absence de sonde specifique pour cette region souvent heterochromatine donc centromère
C’est quoi une disomie uniparentale ? (Snp-loh)
Anomalie génétique ou un individu hérite des deux copies d’un chromosome d’un seul parent
Entraine une perte d’heterozygotie
Quelle est la limite des micro puce d’ADN ?
Limite en génétique constitutionnelle
Ne detectent pas les translocations équilibrées !
C’est quoi les puces CGH-SNP ?
Tres haute résolution utilise pour des genes pertinents dans des cas cliniques
C’est quoi les puces CGH-SNP ?
Tres haute résolution utilise pour des genes pertinents dans des cas cliniques
Explication du séquençage automatise par PCR ?
PCR + sequencage de sanger avec ddNTPS Fluorescents ect…
Precis mais tres long
Uniquement pour les courts fragments d’ADN
Le WGS ?
Sequencage complet du genome gene codant et non codant bien mais tres volumineux en terme de données (besoin d’outils bio informatique)
NGS ?
Sequencage a haut debit qui permet de sequencer des millions de fragments d’adn en parallele.
Tout le génome d’un coup si on veut
Rapide efficace pas cher
Besoin de peu d’adn on peut sequencer l’adn d’une seul cellule
Possible d’analyser plusieurs spécimen avec une seule puce
C’est quoi le WExS ?
Whole exome sequencing :
Analyse seulement ADN CODANT
Soit 1% du genome
85% de toutes les mutations pathologiques impliquent les exons
Entre un WExS et un WGS qui est plus facile a analyser ?
WExS
C’est quoi le sequencage du transcriptome ?
Sequencage de toute les molecules ARN presentent dans une pop cellulaire
Inclut ARNt,ARNr les non codants ect…
C’est quoi le WEPS ?
Se concentre sur l’epigenetique donc le séquencage de régions promotrices et régulatrice du génome comme les sites de méthylation
Identifie les genes qui sont anormalement actives ou inhibes
Therapie epigentique
Est-il plus cher ou moins cher d’étudier le génome complet ou l’exome complet que de séquencer quelques gênes soupçonné par le diagnostic différentiel ?
Moins cher mais bcp de donnees et pb ethique
Quels sont les problèmes éthiques liées aux séquençage ?
Genere de l’information non demandée, mais les logiciels peuvent filtrer pour montrer seulement les gènes recherchées. Par contre il y a une liste de 54 gènes qui doivent être rapportés si mutés
5 etapes du sequencage NGS ?
- Fragmentation ADN
2.Ajout adaptateur et denaturation en ADNsb
3.hybridation sur puce - Amplifaction par pcr en pont avec ajout de N fluorescent
- Lecture et alignement
