CM3 : Utilisation des microorganismes Flashcards
Définition des protéines recombinantes ?
Protéines produites par des cellules dont l’ADN a été modifié par recombinaison génétique
Quelles sont les étapes nécessaires à la production des protéines recombinantes ?
- Amplification des séquences d’intérêt de façon exponentielle
- Insertion du gène altéré dans un vecteur par ligation
- Transfert du vecteur par transformation
- Une fois que la cellule a intégré le vecteur => peut exprimer la protéine
Que sont les bactéries ?
Organismes unicellulaires, elles ont un seul chromosome et sont dépourvues de membrane nucléaire
Quelles sont les bactéries les + utilisées pour produire des protéines recombinantes ?
Gram -
Quels sont les éléments qui composent les plasmides ?
- ORI (origine de réplication)
- Polylinker
- Un gène de résistance à un antibiotique
Rôle des endonucléase pour la production des prot recombinante avec les bactéries ?
Reconnaissent des sites spécifiques sur les plasmides, clivent l’ADN ce qui favorise l’ouverture puis l’insertion d’une nouvelle séquence d’ADN étranger
Qu’est-ce que le phénomène de transformation ?
Introduction de l’ADN recombinant dans la bactérie
Principe de la transformation par choc thermique ?
-1- on stresse les bactéries en les mettant à 4°C
-2-On passe subitement à 42°C créant un choc thermique
=> Crée des pores dans les bactéries, par lesquels entrent les plasmides
Principe de la transformation par choc électrique ?
Soumet les bactéries à un champ électrique, => crée des pores
Quels sont les éléments indispensables à la production de prot recombinante chez la bactérie ?
- Origine de réplication bactérienne (ORI)
- Promoteurs
- Gène de résistance à un antibiotique
- Site de multiclonage (polylinker) pour insérer le gène d’intérêt
- Séquences responsables de la traduction (RBS)
- Séquences responsables de l’arrêt de la transcription
Quelles sont les espèces bactériennes les plus utilisées pour la production de protéines recombinante ?
Escherichia Coli = entérobactérie
Produit : l’insuline, l’hormone de croissance humaine, IL2, Interferon-Gamma
Avantage de l’utilisation des Escherichia Coli ?
- Cultivables en
grandes quantités, car adaptation à
l’anaérobie - La protéine recombinante peut
représenter 25% des protéines totales
Inconvénient de l’utilisation Escherichia Coli pour la production des protéines recombinantes ?
- Protéines intracellulaires
- Présences de corps d’inclusions : il faudra désagréger les protéines + peu de protéines chaperonnes
- Produit trop de protéines cela peut être toxique, nocif
Qu’est-ce qui favorise la production des corps d’inclusions lors de la production des protéines recombinantes ?
- Précipitation de la protéine exprimée
- Peu de protéine chaperonne
- Pas de modifications post-traductionnelles
Que doit être fait pour éviter la formation des corps d’inclusions ?
- Intègre des protéines chaperonnes => favorise la bonne conformation de la protéine
- Fusionner un gène qui code pour une protéine altérée avec un gène qui code pour une protéine soluble
- Baisser la T° lors de la production : système des promoteurs thermorégulés
Avantage de l’utilisation de séquence d’adressage ?
- Simplicité de la purification
- Formation de ponts disulfure
Inconvénients de l’utilisation de séquence d’adressage ?
- Le peptide signal n’est pas suffisant : le rendement est faible
- Corps d’inclusion peuvent se former
Quelles sont les origines les plus utilisées ?
● ColE1 : permet d’obtenir 15-20 copies de notre plasmide / cellule
● p15A : 10-12 copies/cellules
● pUC : 100 à 700 copies/cellules
Quels sont les gène de sélection de résistance aux antibiotiques les plus utilisés ?
- AmpR,
- KanR,
- ChlR,
- TetR
Avantage du promoteur plac ?
- Promoteur fort
- Activation rapide
- IPTG non métabolisé
- Régulation fine
Inconvénients du promoteur plac ?
Inconvénient
* Formation de corps d’inclusion
* IPTG coûteux
Caractéristiques du système T7 polymérase ?
- Système en 2 temps
- Produit des quantités importantes de la protéine d’intérêt
- Contrôler l’expression de la protéine d’intérêt par un système INDIRECTE
Quelles sont les souches les plus utilisées pour contrer des problèmes d’expression généraux ? (prot recomb avec bactéries)
- Souche BL21
- Souche BL21 DE3
Quelles sont les souches les plus utilisées pour contrer des problèmes d’expression ? (prot recomb avec bactéries)
- Souche RIL/RP
- Souche RILP/Rosetta
