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Master UE2A Biotech > CM3 : Utilisation des microorganismes > Flashcards

CM3 : Utilisation des microorganismes Flashcards

1
Q

Définition des protéines recombinantes ?

A

Protéines produites par des cellules dont l’ADN a été modifié par recombinaison génétique

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Q

Quelles sont les étapes nécessaires à la production des protéines recombinantes ?

A
  1. Amplification des séquences d’intérêt de façon exponentielle
  2. Insertion du gène altéré dans un vecteur par ligation
  3. Transfert du vecteur par transformation
  4. Une fois que la cellule a intégré le vecteur => peut exprimer la protéine
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3
Q

Que sont les bactéries ?

A

Organismes unicellulaires, elles ont un seul chromosome et sont dépourvues de membrane nucléaire

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4
Q

Quelles sont les bactéries les + utilisées pour produire des protéines recombinantes ?

A

Gram -

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5
Q

Quels sont les éléments qui composent les plasmides ?

A
  • ORI (origine de réplication)
  • Polylinker
  • Un gène de résistance à un antibiotique
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6
Q

Rôle des endonucléase pour la production des prot recombinante avec les bactéries ?

A

Reconnaissent des sites spécifiques sur les plasmides, clivent l’ADN ce qui favorise l’ouverture puis l’insertion d’une nouvelle séquence d’ADN étranger

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7
Q

Qu’est-ce que le phénomène de transformation ?

A

Introduction de l’ADN recombinant dans la bactérie

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8
Q

Principe de la transformation par choc thermique ?

A

-1- on stresse les bactéries en les mettant à 4°C
-2-On passe subitement à 42°C créant un choc thermique
=> Crée des pores dans les bactéries, par lesquels entrent les plasmides

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9
Q

Principe de la transformation par choc électrique ?

A

Soumet les bactéries à un champ électrique, => crée des pores

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10
Q

Quels sont les éléments indispensables à la production de prot recombinante chez la bactérie ?

A
  • Origine de réplication bactérienne (ORI)
  • Promoteurs
  • Gène de résistance à un antibiotique
  • Site de multiclonage (polylinker) pour insérer le gène d’intérêt
  • Séquences responsables de la traduction (RBS)
  • Séquences responsables de l’arrêt de la transcription
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11
Q

Quelles sont les espèces bactériennes les plus utilisées pour la production de protéines recombinante ?

A

Escherichia Coli = entérobactérie
Produit : l’insuline, l’hormone de croissance humaine, IL2, Interferon-Gamma

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12
Q

Avantage de l’utilisation des Escherichia Coli ?

A
  • Cultivables en
    grandes quantités, car adaptation à
    l’anaérobie
  • La protéine recombinante peut
    représenter 25% des protéines totales
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13
Q

Inconvénient de l’utilisation Escherichia Coli pour la production des protéines recombinantes ?

A
  • Protéines intracellulaires
  • Présences de corps d’inclusions : il faudra désagréger les protéines + peu de protéines chaperonnes
  • Produit trop de protéines cela peut être toxique, nocif
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14
Q

Qu’est-ce qui favorise la production des corps d’inclusions lors de la production des protéines recombinantes ?

A
  • Précipitation de la protéine exprimée
  • Peu de protéine chaperonne
  • Pas de modifications post-traductionnelles
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15
Q

Que doit être fait pour éviter la formation des corps d’inclusions ?

A
  • Intègre des protéines chaperonnes => favorise la bonne conformation de la protéine
  • Fusionner un gène qui code pour une protéine altérée avec un gène qui code pour une protéine soluble
  • Baisser la T° lors de la production : système des promoteurs thermorégulés
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16
Q

Avantage de l’utilisation de séquence d’adressage ?

A
  • Simplicité de la purification
  • Formation de ponts disulfure
17
Q

Inconvénients de l’utilisation de séquence d’adressage ?

A
  • Le peptide signal n’est pas suffisant : le rendement est faible
  • Corps d’inclusion peuvent se former
18
Q

Quelles sont les origines les plus utilisées ?

A

● ColE1 : permet d’obtenir 15-20 copies de notre plasmide / cellule
● p15A : 10-12 copies/cellules
● pUC : 100 à 700 copies/cellules

19
Q

Quels sont les gène de sélection de résistance aux antibiotiques les plus utilisés ?

A
  • AmpR,
  • KanR,
  • ChlR,
  • TetR
20
Q

Avantage du promoteur plac ?

A
  • Promoteur fort
  • Activation rapide
  • IPTG non métabolisé
  • Régulation fine
21
Q

Inconvénients du promoteur plac ?

A

Inconvénient
* Formation de corps d’inclusion
* IPTG coûteux

22
Q

Caractéristiques du système T7 polymérase ?

A
  • Système en 2 temps
  • Produit des quantités importantes de la protéine d’intérêt
  • Contrôler l’expression de la protéine d’intérêt par un système INDIRECTE
23
Q

Quelles sont les souches les plus utilisées pour contrer des problèmes d’expression généraux ? (prot recomb avec bactéries)

A
  • Souche BL21
  • Souche BL21 DE3
24
Q

Quelles sont les souches les plus utilisées pour contrer des problèmes d’expression ? (prot recomb avec bactéries)

A
  • Souche RIL/RP
  • Souche RILP/Rosetta
25
Q

Quelles sont les souches les plus utilisées pour contrer des problèmes de solubilité ? (prot recomb avec bactéries)

A
  • Souche Origami
  • Souche Tuner
26
Q

Quelles sont les souches les plus utilisées pour contrer des problèmes de marquage de protéines ? (prot recomb avec bactéries)

A

Souche B834

27
Q

Quelles sont les méthodes utilisées pour l’extraction des protéines recombinantes des bactéries ?

A
  • Le froid/chaud
  • Les enzymes
  • Sonication
28
Q

Quels sont les inconvénients des systèmes bactériens pour la production de protéines recombinantes ?

A

Production de prot non envisageable si :
● La protéine doit avoir une activité biologique comme une activité d’AC
● La protéine nécessite des modifications post traductionnelles
● La protéine nécessite un repliement

29
Q

Condition de culture des cellules d’insectes ?

A
  • à 27 degrés
  • Avec un pH entre 6 et 6,5
  • Le milieu qualifié de “grâce” => favorise la croissance / prolifération des cellules
30
Q

Avantage de l’utilisation de vecteurs baculoviraux ?

A

● Promoteur très fort, niveau d’expression élevée
● Modifications post-traductionnelles proches du système mammifère : glycosylations
● Capacité insertion de gros fragments
● Production aisée de titres infectieux
● Pas d’infection possible de l’homme

31
Q

Inconvénients de vecteurs baculoviraux ?

A
  • Lytiques
  • Formation des virus recombinants est une étape limitante
  • Cellule hôte va produire un seul passage de virus
32
Q
A

Master UE2A Biotech (13 decks)

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