CM13 : Les animaux transgéniques Flashcards
Définition animal transgénique ?
Animal dont le génome a été modifié de manière artificielle, suite à une intervention humaine :
* Par l’addition de nouvelles séquences d’ADN = transgénèse additive
* Par la modification de séquences déjà présentes dans son génome (knock-out / knock-in / = transgénèse ciblée)
Que vise la technique de la transgénèse ?
- A introduire de manière stable un (ou plusieurs) gène(s) exogènes dans le génome de l’animal hôte
- A l’expression de ce (ou ces) gènes dans l’animal hôte
- A modifier par ajout, suppression ou remplacement d’un fragment d’ADN, l’information génétique de l’animal hôte
Quelles sont les condition que doivent remplir les organismes modèles de la transgénèse ?
- Vivre en labo et s’y reproduire
- Dans un cadre restreint et sans trop d’exigences
- Se reproduire rapidement et en grand nombre afin de réduire la durée de l’expérience
- Être modifié par génie génétique
Pourquoi crér des animaux transgéniques ?
- Mimer une maladie : étudier les causes, tester de nouveaux ttt
- Etudier les mécanismes d’action de gènes isolés
- Humanisation de modèles animaux
- Toxicologie
- Production de protéines recombinantes
- Amélioration des espèces d’intérêt agronomique
A quoi correspond la transgénèse classique ?
Introduction ADN exogène dans l’organisme de manière non spécifique
=> Technique utilisée pour la transgénèse additive ou classique = intégration au hasard de l’ADN
A quoi correspond le transgène utilisé pour la transgénèse classique ?
= ADN linéarisé avec
- 1 promoteur
- 1 gène codant une protéine du génome ou un gène rapporteur ou un
siRNA
- 1 site polyA
Quel est le but des promoteur constitutif ?
Obtenir l’expression du transgène dans la plupart des tissus voir toutes les ȼ de l’organisme au moyen d’un promoteur ubiquitaire (Viraux, mammifères)
Quel est le but des promoteur tissus-spécifique?
Obtenir l’expression du transgène dans un tissu ou type cellulaire bien précis au moyen d’un promoteur dont l’activité est spécifique d’un organe, d’un tissu ou type ȼr
Quels sont les promoteur tissus spécifique utilisables ? (Foie, Tissu adipeux, Muscle, C pancréatique beta, C gliales)
- Foie : albumine
- Tissu adipeux : aP2
- Muscle : myosine
- Cellules pancréatique beta : insuline
- Cellules gliales : GFAP
Quand est ce que l’on utilise des promoteur conditionnels ?
Quand on veut contrôler le niveau d’expression du transgène
Avantage et inconvénients de la transgénèse classique ?
- Relativement rapide
- Travaille de BM restreint
Inconvénients de la transgénèse classique ?
- Intégration au hasard
- Nécessité de plusieurs lignées
En quoi consiste la transgénèse ciblée ?
Ne pas ajouter un gène qui s’intègre n’ importe où dans génome, mais à le faire se placer au locus voulu dans l’ADN pour :
* Inactiver un ou deux allèles d’un gène
* Exprimer une protéine modifiée
Principe de l’introduction de l’ADN via la recombinaison homologue ?
Sur lignées de ȼ souches embryonnaires totipotentes :
Intégration ciblée s’il y a recombinaison homologue : les ȼ ES sont sélectionnées in vitro avant l’injection dans un blastocystes => réimplantation du blastocyste dans l’utérus de la souris
Comment obtient-on des ȼ ES recombinées ?
=> recombinaison homologue
- C ES extraites de la masse interne du blastocyste
- Mises en culture
- Introduction vecteur avec le gène d’intérêt
- Sélection des rares C l’ayant intégré
Différence recombinaison et recombinaison homologue ?
- Recombinaison : mécanisme naturel utilisé par les C pour réparer les coupures simples et doubles brins de l’ADN
- Recombinaison homologue : recombinaison où les séquences d’ADN sont échangées entre 2 molécules identiques ou similaires
Comment procéder à la création d’un vecteur de ciblage ?
- Vecteur de clonage => portant 1 séq d’ADN capable de participer à un événement de recombinaison sur une région Xsomique spécifique dans la ȼ hôte
- Isolement du gène d’intérêt
- Création de la mutation désirée
- Insertion de ≠ cassettes de sélection
Commet se fait la transfection des ȼ ES ?
Transfection de l’ADN par électroporation des ȼ ES => une fois dans le noyau des ȼ, les gènes mutés prennent la place de l’allèle normal par recombinaison homologue
Comment se fait la sélection des C ES recombinantes ?
- Culture en présence de néomycine => seules les C ayant intégrées le gène de la résistance survivent => SÉLECTION POSITIVE
- Seconde sélection nécessaire pour identifier les C où cette intégration s’est produite => supprimer C où il y a eu intégration aléatoire
Que sont les systèmes d’expression conditionnelle ?
Systèmes inductibles => contrôle de l’expression du gène
- tetracycline inductible system
- Tamoxifen system
- Cre-loxP et Flp-FRT system
Principe du tetracycline inductible system ?
- Utilisation prot de fusion : tTA = tetracycline-controled transactivator
- Tet-OFF : Si ajout de tétracycline quand tTA est fixée sur TRE
- plus d’expression du gène
- tTA se dissocie de TRE = gène OFF
=> Inverse pour tet-ON
Principe du Tamoxifen system ?
En présence d’une protéine de fusion fixée sur un R d’œstrogène :
- Moins Tamoxifen (Ligand) => Prot inactive
- + Tamoxifen (Ligand) => Prot active
Principe du Cre-loxP et flp-FRT system ?
Utilisation d’une recombinase qui recombine à des sites spécifiques : en fonction de l’orientation de la paire de sites, la recombinaison résulte en une inversion ou excision :
- loxP site : Séquence est orientée
- FRT site
Intérêt du Cre-loxP et flp-FRT system ?
On utilise des souris qui existent déjà dans lesquelles le Cre est contrôlée
