Classe 11 Flashcards
Survol du PROCESSUS DE DÉCOUVERTE DU MÉDICAMENT
Processus long, complexe, coûteux et à haut risque
—> 5% des composés fabriqués arrivent en phase clinique
—> >12 ans à partir du lancement du projet jusqu’au lancement du médicament
—> De 5000 à 10000 molécules vont être synthétisées et évaluées pour conduire à un seul médicament
Étapes dans la partie découverte de développement de médicament (5)
• Identification de la cible biologique
• Validation de la cible biologique
˃ Confirmation de son rôle dans la maladie
• Identification des positifs (hits)
• Optimisation des positifs en tête de série
• Optimisation des têtes de série en candidats pré-cliniques
IND vs NDA
‘Investigational New Drug Application and Safety’
• avant essais cliniques
New Drug Application
• après essais cliniques
—> applications à la FDA
Qualités d’une bonne cible biologique:
—> Protéines, gènes ou ARN
(Majorité récepteurs & enzymes)
✓Produit un effet efficace après modulation
✓Ne produit pas d’effets secondaires après modulation (ratio risque-bénéfice)
✓Répond à un besoin clinique et commercial
✓ ‘Druggable’:
˃ Accessible à une petite molécule ou à un autre composé biologique
˃ Lors de la liaison avec ces molécules, provoque une réponse biologique mesurable in vitro, in cellulo et in vivo
Criblage phénotypique
moyen d’identification de cibles biologiques
—> Ne nécessite pas de cible moléculaire préalablement définie
- Identifie molécule active (hit)
- Identifie la cible
• Identifie des cibles biologiques en se concentrant sur les effets observables
(phénotypes) en réponse à une perturbation spécifique dans un système biologique
• Évaluation de petites molécules ou siARN qui perturbent le phénotype → sondes chimiques (probes)
• Identification de la cible (gènes, protéines) à l’aide des sondes chimiques en utilisant la spectrométrie de masse (protéomique)
VALIDATION DE LA CIBLE but?
Confirmer que la cible sélectionnée est pertinente et joue un rôle clé dans la maladie
• Étape importante – inefficacité des candidats cliniques due à un mauvais choix de cible
—> Outils; in vitro jusqu’aux modèles animaux et à la modulation de la cible dans les patients
Techniques pour la validation de la cible
• Technologie ‘anti-sens’ (ASO)
—> oligonucléotides chimiquement modifiés complémentent la région de l’ARNm de la cible et inhibe sa synthèse (dégrade via RNase H)
—> pas très utilisé
• Animaux transgéniques
—> Observation des phénotypes dans l’animal complet après manipulation génétique
(Knock-out, knock-in)
—> Introduction du gène humain qui reproduit le phénotype dans l’animal qui en retour peut être utilisé comme modèle d’efficacité pour tester les molécules
• siARN ou shARN
—> ARN à double brins de 21-24 nucléotides spécifique au
gène à contrôler
—> Empêche l’expression des gènes en clivant cet ARN (via RISC)
—> effet temporaire et partiel
• Ac monoclonaux
—> Interaction avec une région large de la surface de la cible avec des épitopes spécifiques
• Génomique chimique
—> Études de l’effet des composés chimiques sur l’expression des gènes
—> Objectif: identification de nouveaux médicaments et cibles
• CRISPR Cas9
—> Abolie complètement l’expression d’un gène
—> Permet d’identifier et de valider plus solidement une cible
TYPE DE MODALITÉ THÉRAPEUTIQUES
Médicaments à petites molécules : -MAJORITÉ
• Stabilité et disponibilité orale
• Prévisibilité pharmacocinétique et pharmacodynamique
• Facilité de stockage et de transport
• Processus de fabrication plus simple et un coût de production potentiellement plus bas
proteines
oligonucleotides
Différents positifs (hits) (4)
• Positif primaire (primary hit)
—>Résultat positif dans un test de criblage
• Positif confirmé (confirmed hit)
—> Reproductible
—> Spécifique
• Positif validé (validated hit)
—> Structure chimique confirmée par synthèse de novo
—> Sélectivité
—> Effet dépendant de la concentration (dose-réponse)
—> Positif aussi dans essais secondaires (fonctionnels)
• Séries de positifs (hit series)
—> Famille d’analogues chimiques indicatifs de relations structure-activité (SAR)
˃ Identification de pharmacophores: représentation tridimensionnelle simplifiées des caractéristiques structurelles essentielles à une molécule pour maintenir son activité pharmacologique
—> Émergence de SAR
Approche Criblages
• Approche de type ‘force brute’, sérendipité
• Tests biologiques sur un grand nombre de molécules
Types de criblages (6)
• Criblage à haut débit
—> Criblage de la collection entière (grand nombre de molécules – 100k en un jour)
—> Essais in vitro ou cellulaires
—> Systèmes d’automation complexes
—> Aucune connaissance préalable nécessaire de la nature de la/les structure(s) active(s)
• Criblage focalisé
—> Criblage de sous-ensembles de la collection
—> Choix basé sur la connaissance préalable de la nature du chimiotype qui devrait démontrer une activité probable contre la cible
—> Basé sur la littérature et les brevets
• Criblage de fragments
—> Collection de fragments à bas poids moléculaire
—> Testés à haute concentration
—> Accompagné de modelage moléculaire pour la construction et le design de molécules plus complexes basées sur les fragments identifiés
—> Criblage à l’aide de méthodes biophysiques ou in vitro
• Criblage de librairies ‘DNA-encoded’
• Criblage virtuel
—> Modelage moléculaire et pharmacophores utilisés pour cribler des bases de données virtuelles de composés
• Criblage physiologique
—> Criblage in vivo dans les tissus
Criblage phénotypique vs basé sur une cible
phénotypique
• Basé sur une activité biologique
• Mieux transposable aux conditions cliniques
❌ Cible et mécanisme d’action inconnus
basé sur une cible
• la cible protéique est prédéterminée et le mécanisme d’action probablement déjà connu
❌ La translation in vitro/in vivo peut-être difficile
CRIBLAGE PAR FRAGMENTS
• Petites molécules organiques de faible poids moléculaire
1) Règle de 3:
—> MW<300
—> ≤ 3 accepteurs ou donneurs de ponts H
—> PSA<60Å (surface des atomes polaires (O,N,proton))
—> LE ≤ 3.0 (énergie de liaison par atome lourd)
• ‘Drug-likeness’
2) Suite au criblage (virtuel)
—> expériences pour donner idee de la forme que les fragm. prennent
• Cristallographie par RX
• RMN (SAR par RMN)
• Surface plasma resonance (SPR, Biacore)
• Spectrométrie de masse (MS)
• Titration isothermale calorimétrique (ITC)
3) Genèse de nouvelles structures chimiques par fusion des fragments
CRIBLAGE DE FRAGMENTS VS HAUT-DEBIT (HTS)
Librairies de fragments:
+ de diversité structurale
+ de degré de liberté 3D
+ haut taux de hits (3-5% vs 0.1%)
• Comparaison avantageuse du criblage par fragments vs le HTS (en théorie)
CRIBLAGE DE LIBRAIRIES ‘DNA-ENCODED’
Chaque composé chimique est lié de manière covalente à une séquence unique d’ADN, qui agit comme un “code-barres” pour l’identifier
• La librairie est incubée avec la cible d’intérêt (protéine, récepteur, enzyme)
—> composés qui se lient à la cible sont retenus, tandis que les autres sont éliminés
• Les composés retenus sont dissociés de la cible & le “code-barres” ADN attaché est amplifié par PCR et séquencé pour identifier les hits
Avantages:
• Jusqu’à 109 composés peuvent être criblés en même temps (plusieurs milliards de composés)
• Chaque synthon chimique est codé par un tag ADN unique
• Apporte une diversité chimique sans précèdent
• Des lavages et incubations répétés favorisent l’affinité et réduisent les artefacts
• Le séquençage est un processus très rapide (environ 4 semaines)
CRIBLAGE VIRTUEL
Permet l’évaluation de millions de composés en quelques jours et en sauvant de l’$$
—> Complémentaire au HTS – peut inclure l’évaluation de composés virtuels
Arbre décisionnel – recherche in silico
Basé sur la disponibilité d’informations structurales de la cible biologique et/ou du substrat endogène ou tout autre ligand
2 plus communs
• Basé sur le ligand
(On connaît la structure du ligand)
(Génération de pharmacophore – recherche de similarité)
• basé sur la structure
(On connaît la structure de la cible)
-création d’un pharmacophore du site de liaison
pharmacophore
une représentation abstraite et simplifiée des éléments fonctionnels d’une molécule nécessaires pour interagir avec une cible (comme un récepteur ou une enzyme) de manière optimale
• fonctionnalités spécifiques
• positions relatives dans l’espace
• arrangement 3D
peptidomimétique
—> petite molécule conçue pour imiter les propriétés biologiques d’un peptide ou d’une protéine, tout en surmontant certaines de leurs limitations
—> conservant sa capacité à interagir avec la cible biologique et à produire le même effet (optimisé)
Identification de «hits» Basée sur les connaissances
• Dérivés de structures provenant de la littérature ou des brevets
• Information biostructurelle provenant de structures cristallines ou modèles moléculaires
• Dérivés de ligands endogènes – Ex. peptidomimétiques
Ex. Le taxol
—> utiliser une molécule naturelle qu’on sait qui fonctionne
- le modifier pour l’optimiser
Le facteur Z’ dépend de
pour le contrôle qualité
• Séparation entre les signaux positifs et négatifs
• Variabilité des signaux pour les échantillons et les contrôles
• Taille des échantillons
• Sensibilité du test
• Bruit de fond
• Distribution des signaux
ESSAI DE LIAISON (BINDING)
• Mesure l’interaction entre un ligand marqué et une cible
• Ne mesure pas la fonction (pas de distinction agoniste/antagoniste)
• Types d’essais de liaison
—> Expérience de cinétique du ligand (mesure koff et kon; constantes d’association et de dissociation du ligand)
—> Expérience de saturation (Kd; constante d’affinité et Bmax le nombre maximal de récepteurs pouvant réagir)
—> Compétition (mesure de l’IC50 du compétiteur)
ESSAI FONCTIONNEL
Mesure de paramètres fonctionnels cellulaires typiques à un phénotype donné
• Concentration intracellulaire d’ions libres (Ex: Ca++)
• Caractéristiques membranaires (Ex: potentiel)
• Indicateurs de mécanismes cellulaires (Ex: phosphorylation, formation glutathione)
Utilité:
• Validation des positifs (hits)
—> Étape requise pour développement ultérieur
—> dose-réponse indique un effet spécifique
• Criblage des modulateurs allostériques
—> Peuvent être inactifs dans le test de liaison – requièrent un test fonctionnel
—> ex Benzodiazépines (Valium)
Ex. FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) & BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer)
PROCESSUS D’OPTIMISATION EN CHIMIE MEDICINAL
1) cible
2) Positifs ‘Hits’
3) Tête de série
4) Sélection candidat clinique
Ou
Tête de série améliorée
—> But; identifier un/des candidats pré-cliniques afin de démontrer de l’activité dans un modèle in vivo
TECHNIQUES DE CONCEPTION/OPTIMISATION; SAR
1) Approche de conception des analogues
• Modifications de groupements fonctionnels, substituants ou chaînes spécifiques du positif ou de la tête de série
• Re-design de la structure (chimiotype)–«scaffold hopping»
2) Sélection des groupements chimiques pour la synthèse d’analogues structuraux:
• Taille
• Charge
• Structure aromatique
• Hydrophilicité/Lipophilicité
• Potentiel d’échafaudage (backbone)
• Aire de surface polaire
• Nb d’accepteurs et de donneurs de ponts H
• Nb de liens rotatifs
2 types de Conception de Médicaments Assistée par Ordinateur (CADD)
1) Conception de Médicaments Basée sur la Structure (SBDD)
Based on binding site
—> docking
—> molecular dynamic
—> QM/MM
2) Conception de Médicaments Basée sur le Ligand (LBDD)
—> 3D-QSAR
—> Pharmacophore
—> Similarity
analysed by QSAR
‘DOCKING’
Définition et 2 mthodes
—> arrimage moléculaire (Basé sur les structures de la cible et du positif ou de la tête de série)
—> Génération d’algorithmes qui sondent et évaluent la surface du site actif et évaluent le meilleur agencement du ligand avec le site actif
—> prédire la meilleure position, orientation et interaction d’un ligand avec une macromolécule cible
1) méthode générale
• Le ligand (3D) est placé dans la cavité de liaison du récepteur (3D) et les conformations potentielles sont explorées
—> La conformation de liaison la plus probable et les interactions intermoléculaires correspondantes sont identifiées.
2) méthode de construction progressive
• Le ligand est divisé en plusieurs fragments
—> fragment d’ancrage est ancré dans le site de liaison de la cible moléculaire;
—> fragment suivant est ancré après le fragment d’ancrage, etc etc
MÉTHODES DE SYNTHÈSE de molécules (3)
Synthèse conventionnelle (norme)
• Synthèse en solution
• Un composé à la fois – analogues spécifiques
Synthèse parallèle
• Préparation d’un intermédiaire commun
• Dernière étape de la synthèse effectuée avec 10-40 réactifs en réactions séparées en solution
• Analogues purifiés
• Optimisation des positifs ou des têtes de série – librairie focalisée
Chimie combinatoire
• Approche utilisée pour générer de la diversité
• Synthèse en phase solide (billes de polystyrène)
• Création de mélanges complexes de >100 analogues
• Étape de déconvolution nécessaire après le criblage
• Risque d’interaction synergique pouvant mener à des faux positifs
• Peut être codée par ADN, ou DEL pour DNA-encoded Library pour l’identification de positifs
TESTS IN VITRO AND IN VIVO POUR LE DÉVELOPPEMENT DE SAR (5)
Activité – Cible In vitro
• Primaire (souvent « cell-free »)
• Cellulaire
• Fonctionnelle
• Essais secondaires
In vitro ADME (Absorption, Distribution, Métabolisme, Excrétion)
• Stabilité microsomale et/ou hépatique (humain, rat, souris, chien, singe)
• Essais inhibition CYP450/substrat CYP450
• Absorption(Caco-2,PAMPA)
• Transporteur efflux
• Liaison aux protéines
Toxicité
• Test Ames
• Test Micronucleus
• hERG liaison ou patch-clamp
• Induction CYP450
• Criblage général–panel de récepteurs, enzymes, transporteurs etc…
PK In vivo - profil pharmacocinétique
Efficacité In vivo (modèles animaux)
PK
PROFIL PHARMACOCINÉTIQUE
—> l’étude de ce que l’organisme fait au médicament
Importance:
• Détermination du mode d’administration, de la dose et de sa fréquence, de la durée de l’action
Processus:
• Absorption , Distribution, Métabolisme, Excrétion
ABSORPTION
transfert d’un médicament de son site d’administration au flux sanguin
1) Diffusion passive:
• Majorité des médicaments
• Suit le gradient de concentration
• Facteurs impliqués: taille (PM), solubilité dans les lipides, polarité, degré d’ionisation du médicament
2) Transport actif à l’aide de protéines
• Implique des protéines membranaires de transport spécifiques
• Liaison du médicament au transporteur et relâchement de l’autre côté de la membrane
• P-glycoprotéines(MDR-1)
—> Muqueuse intestinale, tubules rénales, barrière encéphalique
• Transporteurs ioniques (cations et anions organiques)
—> Moins important
MESURE CLOGP/LOGP
Mesure de la lipophilicité
—> méthode de Prédiction du potentiel de diffusion passive de molécules
P = Coct / Ceau
LogP faible : composé hydrophile
LogP élevé: composé hydrophobe (lipophile)
• Log P est dépendant de l’ionisation des molécules (donc du pH de la solution)
Pourquoi l’octanol?
• Ratio carbone / oxygène similaire aux lipides membranaires
• Peu soluble dans l’eau (600 mg/L)
cLogP est un logP « calculé » :
• Algorithmes développés pour prédire in silico le LogP des molécules en tenant compte des groupements chimiques individuels constituant la molécule
• Validation en comparant avec les valeurs de LogP obtenues expérimentalement pour un ensemble de molécules de références
MESURE CLOGP/LOGP ET PSA et mesures optimales
A two-descriptor model for passive absorption
clogP entre 0 et 5 = optimal
PSA sous 150 = optimal
TESTS CACO-2 ET PAMPA
Évaluation du potentiel d’absorption (p.o.) d’un grand nombre de composés
—> tres cher
1) Caco-2:
• Lignées de cellules épithéliales intestinales qui forment une monocouche cellulaire lorsque cultivées sur support plastique ou sur un filtre
• Molécule placée sur la surface apicale
• Mesure du taux de transfert de la face apicale vers la face basolatérale
en fonction du temps (0-180 min)
• Reproduction des phénomènes de diffusion passive et active (transport actif)
2) PAMPA (Parallel artificial membrane permeability assay)
• Filtre enduit d’une membrane artificielle faite d’un matériel lipidique dans un solvant organique
• Perméabilité calculée en mesurant la concentration du composé dans les deux chambres après incubation
• Mesure seulement la perméabilité passive, sans les phénomènes de transport actif
• Mesure possible à différents pHs
METABOLISME de drogues
Biotransformation des composés xénobiotiques
—> Effet majeur sur le profil pharmacocinétique:
• Biodisponibilité: fraction de la dose de médicament administré qui parvient à la circulation générale
• Clairance
• Intensité et durée de l’effet du médicament
Réaction en 2 phases:
Phase 1 (Fonctionnalisation)
• Insertion de nouveaux groupements fonctionnels polaires - CYP450
• Permutation de groupements fonctionnels existants
• Déprotection de groupements fonctionnels existants
Phase 2 (Réactions de conjugaison)
• modifications sur les groupement fonctionnels déjà présents sur la molécule ou introduits en Phase 1 – augmente la solubilité aqueuse en général
TESTS DE METABOLISME in vitro
1) Préparations d’enzymes microsomiales
—> Homogénéisation de tissu hépatique ou intestinal
—> Isolation des microvésicules (microsomes - riches en CYP450) par centrifugation différentielle
2) Effet d’inhibiteurs spécifiques à certains isoformes de CYP450 permet d’identifier les CYP450 impliqués dans le métabolisme du composé
& d’identifier les métabolites produits
3) métabolites caractérisés:
Structure
Fonction (nulle?, positive? négative?, toxique?)
LIAISON AUX PROTÉINES PLASMATIQUES des médicaments
Affinité des médicaments
• 10-3 à 10-5 M (Kd)
Type de liaisons
• Liaison rapide et réversible
• Sites de liaison différents pour les molécules anioniques et cationiques
• Liaisons ioniques et liaisons de Van der Waals
• Importance de la liaison est corrélée avec le caractère hydrophobe de la molécule —> plus une molecule est lipophile - plus elle se lie aux proteines
Concentration de la forme libre a un effet important
• Distribution dans les tissus
• Accessibilité du médicament au site d’action
• Vitesse d’élimination du médicament
Méthodes de détermination de la forme libre
• Equilibrium dialysis
• Ultra filtration
• In vitro Serum Shift Assay
Quel test d’inhibition est fait pour les nouv. Médicaments
TEST D’INHIBITION DE hERG (human ether-a-go-go related gene)
—> ⬆️ le risque d’arythmies cardiaques (“Torsade de Pointes”) causant la mort subite
• Mécanisme: inhibition d’un canal potassique cardiaque (hERG)
• Type de toxicité causé par le médicament lui-même ou suite à une
interaction médicamenteuse
• tests de depistage in vitro
Essais :
• Liaison (FLIPR)
—> mesure activite cellulaire en temps réel
—> surveillant les flux ioniques ou les variations de concentration de calcium.
• Patch-clamp dans des cellules HEK293 or CHO transfectées avec hERG
—> technique électrophysiologique permettant de mesurer les courants ioniques à travers des canaux spécifiques, ici le canal hERG
—> cellules HEK293 ou CHO sont souvent utilisées comme modèles parce qu’elles peuvent être facilement transfectées pour exprimer des protéines spécifiques comme hERG
hERG SAR
l’analyse des relations structure-activité (Structure-Activity Relationships) concernant le canal ionique hERG (human Ether-à-go-go-Related Gene)
Structure:
• Grande cavité interne cylindrique: peut accommoder de larges molécules
• Haute densité de résidus aromatiques et polaires: possibilité d’interactions multiples simultanées
• Arrangement hautement symétrique: plusieurs orientations de liaison possibles
Local Pharmacophores:
amine protonée au centre entouré de gros cycles aromatiques
Le test Ames
Test bactérien qui simule ce qui peut se passer chez l’humain.
• Les b ont des mutations dans les gènes impliqués dans la synthèse de l’histidine (requiert l’histidine pour leur croissance)
• Le test mesure la capacité de la molécule à créer des mutations qui permettent à la b de croître sans histidine
• Extraits de foie de rat sont ajoutés pour simuler l’effet du métabolisme
• Pouvoir prédictif (mutagènes qui sont cancérigènes) : 70-90%
• Sensibilité (cancérigènes qui sont mutagènes) : 40-50%
—> Donne une approximation du pouvoir cancérigène d’une molécule et ses métabolites (produits via enzymes hépatiques)
