Classe 1 Flashcards
Le projet HUGO
(Human Genome Organisation)
—> a identifié et séquencé tous les gènes humains (2003) et il a permis l’identification de d’innombrables mutations néfastes
Gènes dans le génome (#?)
20 - 25 000 gènes
(mais l’épissage alternatif permet la synthèse de beaucoup plus de
25 000 protéines)
Applications de techniques de Biologie Moléculaire:
- Génétique
- Dx (Dx pré natal aussi) - Oncologie
- identifier les porteurs de certaines mutations prédisposant aux cancers
-modulation du traitement par rapport aux mutations tumorales - Microbiologie
-identifier organismes (bactéries, mycobactéries) avec technique de PCR
- PCR peut même identifier leurs gènes de résistance aux antibiotiques - Médecine légale
- recherche des RFLPs
(incriminer ou d’éliminer avec une certitude presque absolue un suspect, avec un cheveu, une goutte de sang ou de sperme)
(résoudre les cas où la paternité est en jeu)
deux types généraux de modalités diagnostiques moléculaires
1) évaluent l’ADN
—> évaluent si un gène est présent ou non, et s’il est muté
2) évaluent l’ARN
—> information sur la transcription de ce gène (ce gène est actif ou non dans un tissu ou dans une cellule)
Les tests d’ADN
Southern,
le PCR,
la FISH,
le CGH
le SNP
tests qui évaluent la transcription (i.e., l’expression génique)
le Northern,
le RT-PCR,
les puces évaluant l’ARN,
le buvardage de Western
Solubilité dans le chloroforme/phénol
L’ADN —> pas soluble
Les protéines et les membranes cellulaires,+ les autres composantes cellulaires —> très solubles
(l’eau n’est pas miscible avec le mélange chloroforme/ phénol, et l’ADN est très soluble dans l’eau)
ADN génomique
contient les introns
les exons géniques,
+ les séquences non-codantes
Enzymes de restriction:
enzymes que reconnaissent une séquence de paire de bases (pb) de façon très précise,
—> ne coupe que cette séquence
—> différence d’un seul nucléotide empêche l’action de ces enzymes
—> une mutation qui induit ou supprime un site de restriction peut facilement être mise en évidence
EcoR1
Enzyme de restriction qui reconnaît GAATTC (un palindrome)
—> donne extrémités cohésives (collantes) : on peut recoller 2 fragments différents si ils ont tous deux été coupés par EcoR1
Fréquence des coupures par les enzymes de restriction
Technique de Southern: méthode
1) digestion par Enzymes de Restriction de l’ADN purifié
—>chaque fragments : longueur différente = chaque fragments aura un poids moléculaire et une charge différente
2) electrophorese sur gel d’agarose
—> pour séparer les fragments de restriction suivant leur longueur,
+ grands = moins mobiles,
+ petits = migrent le plus loin
(Visualisation avec BrET + UV)
3) Transfert de l’ADN sur une membrane
(nylon ou en nitrocellulose)
4) hybridation avec sondes complémentaires à la séquence recherchée à l’ADN dénaturé
(segments d’ADN marqués radioactivement ou enzymatiquement)
5) Identification des séquences d’intérêt avec film radiographique
—> on peut manipuler les conditions d’hybridation afin de favoriser la stringence (conditions ne permettant qu’une hybridation parfaite) ou la permissivité
Southern utilisations
1) détecter la présence de micro-organismes dans un échantillon: on utilise une ou des sondes spécifiques
2) détecter des allèles mutés de poids moléculaire différent de l’allèle “normal” (RFLP)
3) évaluer la quantité d’ADN présent dans l’échantillon
southern quantitatif
4) détecter des allèles mutés lorsque cette mutation induit ou supprime un site de restriction
5) déceler des mutations ponctuelle
ASO
Inconvénients southern
1) ++manip. = $$$$
2) étapes longues = pas de Dx rapide
3) besoin de grandes quantités d’ADN
(pour hybrider suffisamment de sonde pour avoir un signal décelable)
technique des ASO
(Allele Specific Oligonucleotide)
1) étudie les sondes ASO:
expériences pour déterminer la température pour laquelle les brins parfaitement homologues se dénaturent (sonde ASO / ADN génomique)
2) prend notre sonde et on l’hybride avec l’ADN à étudier (conditions stringentes)
3) chauffe la solution à une température très légèrement inférieure à la température de fusion (dissociation)
—> sonde reste hybridée = homologie parfaite
—> sinon (pas de signal)= différence d’au moins un nucléotide entre la sonde et l’ADN génomique
Southern- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) méthode & utilisation
“polymorphisme de longueur des fragments digérés”
—> utilisée pour différencier les allèles d’un gène qui nous intéresse (test paternité, identification génotype)
—> avec plus de sondes: permet d’incriminer ou d’éliminer un suspect en comparant son ADN à celui qui fut retrouvé (sur victime ou au crime)
• Sondes connues comme reconnaissant des séquences très polymorphes (en taille)
• Statistiquement, deux
individus ne peuvent
avoir les mêmes longueurs d’allèles pour toutes ces séquences
Comment:
1) southern (isolation ADN, clivage par enz. de restriction, electrophorese, passage à membrane)
2) hybridation avec plusieurs sondes pour déterminer longueurs différentes des allèles
allèle: fragments d’ADN sur lesquels sont situés les gènes qui nous intéressent (“fragments de restriction”)
—> peuvent être de taille variable
—> segment d’ADN du gène entre la boîte TATA et le codon Stop est de même longueur sur tous les fragments
2 raisons qui expliquent les différences de taille entre les fragments de restriction
1) portion incluse entre les sites de restriction peut contenir des séquences répétées à différent #
(Alu, LINE, SINE, (CA)n, microsatellites)
2) différence d’un seul nucléotide peut générer ou oblitérer un site de restriction = fragment d’ADN plus court ou plus long
(polymorphismes au niveau de l’ADN non codant ou dans une séquence codante)
—> ex. Drepanocytose (mutation ponctuelle du codon GAG—>GTG au niveau de la séquence codante du gène de l’hémoglobine)
Hybridation sur tache:DotBlot
technique d’hybridation autre que le Southern bcp + rapide que Southern=pas digestion, electrophorese et transfert sur membrane
Méthode
1) ajoute directement une goutte de la solution d’ADN non digéré (ou le produit d’amplification par PCR) sur une membrane
—> 100 à 10 000 échantillons par membrane
2) hybridation avec la sonde d’intérêt
3) révéler sonde
—>favorisée pour:
A- évaluer un grand # d’échantillons rapidement pour la présence ou l’absence d’un gène (criblage de population),
B- quand taille du fragment d’ADN détecté n’est pas importante (lorsqu’on cherche une réponse « oui/non »)
Technique de Western
étudie les protéines
1) Électrophorèse des protéines dans un gel SDS-PAGE
2) Transfert du gel vers la membrane
3) Visualisation des protéines avec anticorps (Immunodétection)
—> immunohistochimie permet de voir localisation de la protéine mais pas les isoformes et des polymorphismes d’une protéine
PCR (Polymerase Chain Reaction) classique
1) ADN d’une ou + cellules —> suspension dans une solution contenant les amorces(à excès), des nucléotides et de la polymérase
2) dénature ADN (95C)
3) hybride amorces (60C)
4) permettre à la polymérase de synthétiser les nouveaux brins d’ADN (72C)
5) plusieurs cycles répétés
6)analyse
- electrophorese (afin de voir si il y a eu amplification ou non)
—> si taille du fragment recherché est la = présent dans l’échantillon
—> peut faire hybridation avec sonde via Southern pour 2ble vérification
La polymérase ne fonctionne qu’en 5’ 3’
PCR modifications
1) Q-PCR (PCR Quantitatif)
identifier # de copies d’un gène (C-MYC)
identifier charge virale des patients infectés (VIH, EBV, Hépatite)
Amplification avec des nucléotides marqués par des fluorochromes
—> fluorescence est quantifiée pendant chaque cycle d’amplification de PCR-Real-Time
—> # de copies présentes dans l’échantillon est déterminée par le # de cycles d’amplification requis pour générer 2,4 u de fluorescence
3 phases:
1) phase de latence (exponentielle, sous seuil de détection)
2) exponentielle
3) plateau
2) RT-PCR
-isole ARNm —> cDNA (contient que les exons)
par transcriptase inverse
-continue PCR
Avantages et inconvénients PCR
Avantages:
- Dx en quelques heures
- nécessite de très petites quantités d’ADN
- peut faire 96 tests à la fois
- nécessite pas ADN purifié (** southern oui**)
- pas cher
Inconvénients :
- ne peut être faite que si les amorces nécessaires sont connues (séquence du gène est connue)
- limite de taille (ne peut amplifier des séquences de plus de quelques milliers de pb) - RT-PCR peut être solution
Caryotype conventionnel
Résolution de 450 bandes
~ 45 gènes par bande
Sonde de fusion & de séparation
FISH
Fusion - pour voir si 2 gènes spécifiques (identifiés) sont fusionnés
Ex. fusion génétique entre les gènes BCR et ABL1 = leucémie myeloide chronique
separation - pour voir s’il y a eu une translocation à un endroit précis
-partenaires de translocation sans importance
permet d’utiliser moins de sondes $$
Caryotypage spectral (SKY)
translocations facilement identifiable entre quels chromosomes
$$$$$$$$
Trois catégories de translocations oncogéniques
1) celles qui perturbent un gène suppresseur de tumeur, ou causent sa délétion;
2) celles qui couplent un promoteur physiologiquement actif avec un proto-oncogène qui devrait être inactif (Fig. 15 A); t(8;14) du lymphome de Burkitt
3) celles qui forment une protéine chimérique (Fig. 15 B1 et B2); t(11;22) fusionne gènes EWS et FLI-1 = protéine chimérique du sarcome de Ewing
—> mises en évidence par FISH, Southern
—> longs segments d’ADN non-codant dans ces gènes remaniés empêche généralement l’amplification par PCR (RT-PCR peut être utilisé)
SNP – Single nucleotide Polymorphism
Puces pour polymorphismes d’un seul nucléotide
Individu normal = 46 chr. différents
(polymorphismes sont distribués uniformément sur tout le génome)
—> on analyse les loci (2 sondes par loci)
- chaque région chromosomique devrait révéler des polymorphismes (dans les 2 chr.) (i.e., des allèles hétérozygotes)
—> Chaque locus peut exprimer les polymorphismes A ou B : ainsi, le génotype de chaque locus peut être AA, AB ou BB
—> Une puce SNP peut évaluer plus d’un million de loci
-
normal
en moyenne, pour chaque locus, 1⁄4 sont AA, 1⁄4 sont BB et 1⁄2 sont AB
Amount of DNA=0 (log) -
trisomie (ou isomie)
•chaque locus étudié pourra avoir AAA, AAB, ABB ou BBB
Amount of DNA>0 (log) - trisomie
Amount of DNA<0 (log) - monosomie
-
isodisomie
quantité d’ADN = 0 (log) - cellule diploïde
2 segments identiques = pas de locus hétérozygote : il n’y a que des AA et des BB (LOH, ou Loss of heterozygosity)
—> peut être segment chr. Ou chr. Complet
Micropuces d’ADN (DNA
microarray) - CGH
ADN à analyser (vert) + ADN témoin (rouge)
• si même qté: jaune
• si + d’ADN (duplication de segm. chr. ou chr. entier): plus vert
• si une délétion: plus rouge
—> être utilisé pour déterminer l’expression des gènes d’intérêt (suite à digestion d’ADN avec ADNase)
=micropuce d’expression génique
• transforme ARN en cDNA et coloré en vert = intensité du signal vert indique le degré d’expression du gène
Micropuces ADN avantages & inconvénients
Avantages:
• identifie de façon précise les exons délétés
• moins cher que caryotype
• nécessite peu d’ADN (100ng d’ADN purifié)
• vite (-48h)
• nécessite pas de mettre les c en culture pour obtenir des métaphases (un sine qua non pour une étude caryotypique)
Inconvénients:
• ne décèlent pas les translocations équilibrées
CGH sur chromosome
Nécessite métaphases normales
—> peut être fait sur puce (meilleur)
WGS
séquencer le génome complet
—> moins cher que de séquencer les quelques gènes qui pourraient expliquer l’état clinique
• qtes astronomique d’information (~ 1 Tb) -nécessite équipes en bioinformatique
•permet l’identification de translocations équilibrées et non-équilibrées
• Dx Prénatal : ADN foetal dans le sérum maternel circulant —> permettrait d’éviter les complications liées à l’amniocentèse et aux biopsies des villosités choriales
WExS
Whole Exome Sequencing
première ligne d’investigation clinique, plutôt que le WGS + facile analyse
• Service de bio-informatique requis
• portion codante de l’ARNm (1% de tout notre génome)
• mutations de l’exome représentent vraisemblablement 85% des mutations causant des maladies
(l’exome d’un type de cellules, ou d’un tissu comme le foie qui est composé de plusieurs types de cellules, est appelée le transcriptome)
Séquençage « Next Generation Sequencing »
nécessite que de minuscules quantités d’ADN : permet de séquencer l’ADN d’une seule c (p. ex., Dx sur une cellule embryonnaire pré-implantation)
1) couper l’ADN du génome de milliers de cellules en petits segments.
2) Des « adapteurs » d’ADNdb sont ensuite liés aux extrémités de chacun de ces segments, et les segments sont ensuite dénaturés en ADNsb.
3) séquence d’adapteur permet d’hybrider ces segments à des brins d’ADNsb collés à la puce
4) fragment d’ADNsb de chaque spot est converti en ADNdb (par PCR)
5) fragment d’ADNdb de chaque spot est dénaturé —> ADNsb
6) brin d’ADNsb se plie et sa sequence complémentaire se lie à l’adapteur libre à sur la puce, avec formation d’un pont
7) vagues successives d’amplification par PCR génèrent des milliers de fragments d’ADN identiques dans chaque spot
8) lavage d’un oligonucleotide = une seule direction de lecture
9) dernière amplification se fait avec des nucleotides liés à un fluorochrome —> lecture par machine
10) Une fois la lecture complétée, les séquences obtenues sont “alignées”
—> peut séquencer plusieurs échantillons sur une même puce (en utilisant des adaptateurs différents)
• moins $
• moins “profondeur” de lecture
