C2 Técnicas de estudio célula

Question 1

¿Cómo se clasifican los microscopios?

Answer 1

• Óptico: haz luz blanca como fuente

- Electrónico: haz de electrones como fuente

Question 2

¿Es lo mismo aumento y resolución o nitidez?

Answer 2

No, aumento es la magnificación que logra el equipo y resolución o nitidez distancia mínima a la cual un equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas

Question 3

Cuanto más juntos estén los puntos y se ven separados …

Answer 3

Mayor resolución como microscopio electrónico en comparación con el óptico u el ojo humano

Question 4

En el microscopio óptico se obtiene una imagen…

Answer 4

Real, invertida y aumentada

Question 5

¿Qué parte del microscopio es la encargada del aumento?

Answer 5

Los lentes

Question 6

¿Cuántos tipos de lentes hay y cuáles son sus características?

Answer 6

Oculares: posamos la vista en ellos, tienen número que indica aumento.
-Objetivos: colocados en revolver, tienen sistema de amortiguación (sist. de protección por si se acerca mucho a la muestra) y tienen colores que indican aumento.

Question 7

El aumento total es igual a ….

Answer 7

Aumento lente ocular * aumento lente objetivo

Question 8

¿Cuáles son los límites de resolución del ojo humano, microscopio óptico y electrónico?

Answer 8

Ojo: 200 micrometros
Óptico: 200 nanometros
Electrónico: 2 angstrom

Question 9

Poder de resolución es inversamente proporcional al …

Answer 9

Límite de resolución

Question 10

A menor longitud de onda…

Answer 10

Mayor resolución, por eso la microscopia electrónica es mejor

Question 11

¿Qué es apertura numérica (AN)?

Answer 11

Capacidad de lentes objetivos para captar haces de luz de la fuente de iluminación y hacerlos incidir sobre la muestra

Question 12

A menor AN …

Answer 12

Menor resolución

Question 13

A mayor AN …

Answer 13

Mayor resolución

Question 14

Características de los objetivos secos y en inmersión

Answer 14

• Objetivos secos: rayos de luz se dispersan, no llegan todos a la muestra, menos resolución, mayor campo visual.
• Objetivos inmersión: rayos de luz focalizados en la muestra, mejor resolución pero menor campo visual

Question 15

El aceite de inmersión modifica la muestra?

Answer 15

No

Question 16

El aceite de inmersión mejora el aumento?

Answer 16

No, mejora solo la resolución, el aumento no depende de este

Question 17

Tipos de microscopio electrónico

Answer 17

• Transmisión
• Barrido
• Digital
• Efecto túnel o cuántico

Question 18

Características microscopio electrónico de transmisión (MET)

Answer 18

• Usa imanes para conducir electrones a la muestra, no usa lentes
• Se pueden ver ultraestructuras
• Electrones como fuente de luz

Question 19

En el MET, NO se transmiten los electrones en las zonas …

Answer 19

Electrondensas

Question 20

En el MET, se transmiten los electrones en las zonas …

Answer 20

Electrolúcidas

Question 21

Características microscopio electrónico de barrido (SEM)

Answer 21

• Imágenes 3D
• Permite observar células muertas *
• Usa detectores de electrones para guiarlos a la muestra
• Haz luminoso son electrones

Question 22

Pasos procesamiento histológico de la muestra

Answer 22

1) Obtención muestra
2) Fijación en formalina para que paren sus procesos
3) Deshidratación, sacar agua de la muestra y cambiarlo por formalina
4) Aclaramiento, retirar exceso formalina
5) Impregnación parafina fundida para luego solidificarla
6) Uso microtomo para cortar grosor de la muestra
7) Montar en portaobjetos y tinción

Question 23

Características tinción hematoxilina y eosina

Answer 23

• Hematoxilina: tinción color morado, básica, tiñe núcleo y RER.
• Eosina: tinción color rosado, ácida, tiñe citoplasma.

Question 24

¿Qué se usa para el estudio de proteínas?

Answer 24

Inmunohistoquímica e inmunofluorescencia, ambas en base a anticuerpos

Question 25

Características inmunohistoquímica

Answer 25

• Técnica indirecta
• Anticuerpo primario reconoce proteína y se le une
• Anticuerpo secundario conjugado con enzima peroxidasa (HRPO) reconoce a anticuerpo primario y se unen
• Enzima HRPO actúa con sustrato DAB y en presencia de peróxido de hidrógeno da producto coloreado que precipita sobre proteína identificada

Question 26

Características inmunofluorescencia

Answer 26

• Técnica directa
• Anticuerpo ligado a fluorósforo se une a la proteína.
• Fluorósforo es excitado con luz, emite fotones que se ven como fluorescencia.

Question 27

¿Qué es un microscopio de fluorescencia?

Answer 27

Es uno óptico modificado, usa mercurio como lámpara y varios filtros que permiten elegir la longitud de onda que se quiere ver

Question 28

¿Qué es la proteína fluorescente verde?

Answer 28

Proteína fluorescente de medusa que al fusionarla con la proteína que se quiere estudiar, ésta al expresarse funcionalmente se ve verde.

Question 29

¿Cuáles son las técnicas de sobreexpresión de genes y sus características?

Answer 29

-Transducción retroviral o lentiviral: ingreso de genes por retrovirus que se incorporan al ADN, se mantiene en el tiempo.
-Transducción adenoviral: incorporación de genes mediante adenovirales en un tejido pero no en ADN, se va perdiendo con la mitosis.
-Transafección de plasmidios: plásmidos=ADN de doble hebra circular que se incorporan a células o
tejidos de interés, se pierde a medida que la célula hace mitosis

Question 30

¿Cuáles son las técnicas de silenciamiento de genes y sus características?

Answer 30

• Knockdown: se usa ARN de interferencia (sh ARN) corto y de doble hebra que es complementario a una secuencia de ARNm que codifica la proteína que se quiere silenciar. Esta doble hebra de ARN es reconocida por proteína RISC y degrada a ambos ARNs.
• Knockout con CRISP CAS9: induce una mutación creando un codón de término anticipado, no se podrá traducir porque origina proteína truncada.
• Manipulación directa: se genera mutación en el gen, incorporando codón de término u otra secuencia no normal.

Question 31

Diferencia entre knockout y knockdown

Answer 31

KO: cuando se suprimen los dos alelos de un gen, no se expresa (-/-)
KD: cuando se expresa un gen de forma parcial, se suprime solo 1 alelo (-/+)

Question 32

Mecanismo PCR

Answer 32

1) Tubo con los reactivos se coloca en termociclador (puede aumentar o bajar la T° rápido)
2) T° aumenta, se desnatura ADN, se separan ambas hebras.
3) Se baja la T° para que se unan los partidores (a extremo 3´ de la hebra), fragmento de ADN que se une a un segmento específico de ADN
4) ADN polimerasa inicia síntesis de hebra complementaria desde partidor (extremo 3’) hacia 5’, por lo tanto la hebra sintetizada va de 5’ a 3’
5) Se realizan 20-40 ciclos

Question 33

Mecanismo RT-PCR

Answer 33

1) Lisis de células para extraer ARN total.
2) Separación por fases para obtener ARN total.
3) Usando un partidor oligodT se marca la región de ARN específica
4) Enzima transcriptasa reversa usa partidor oligodT para empezar sintetizar ADN a partir de ARN.

*Lo mismo que PCR pero en base a ARN se obtiene ADN.

Question 34

Mecanismo PCR en tiempo real

Answer 34

Técnica altamente sensible que permite amplificar y cuantificar una secuencia nucleotídica específica usando fluoróforos que se unen a doble hebra (SYBR Green) o sondas secuencias específicas marcadas con fluorósforos (TaqMan) que emiten fluorescencia al formar doble hebra.

*TaqMan es más específica que SYBR, por uso de sonda más partidores

Question 35

Mecanismo hibridación in situ

Answer 35

Permite detectar secuencias de ARN o ADN específicas usando sondas con nucleótidos marcados (ISH) que se unen a hebra por complementariedad de bases. Se usa anticuerpo Ab para ver que células tienen estas secuencias.

Question 36

Mecanismo hibridación in situ fluorescente (FISH)

Answer 36

Se diseña sonda (fragmento de ADN complementario al que se quiere estudiar) marcada con fluorescencia. Al unirse con hebra que se quiere estudiar esta se hibrida y quedará marcada para poder ser vista por microscopio de fluorescencia.
* Se ven alteraciones genómicas

Question 37

Mecanismo electroforesis

Answer 37

Técnica para separar mezclas de proteínas o ácidos nucleicos. Se deposita en matriz con gel y los componentes migran, mediante el uso de fuerza eléctrica, según su peso molecular o tamaño. Los más chicos son los que más se desplazan y se ven más abajo en los resultados, los más grandes quedan más arriba. En los resultados, el grosor o saturación de las bandas indica la presencia de este componente.

Question 38

Mecanismo Western blot

Answer 38

Técnica para distinguir proteínas post electroforesis, se transfieren a membrana nitrocelulosa, se usan anticuerpos primarios específicos para la proteína de interés y otros secundarios específicos para primarios que marcaran a la proteína ya sea por: color, quimioluminiscencia o fluoróforo.

Question 39

Mecanismo Southern blot

Answer 39

Técnica para distinguir secuencias ADN, post electroforesis se pasa del gel a membrana nitrocelulosa y se usa sonda con bases complementarias para que marque la secuencia de interés.

Question 40

Mecanismo Northern blot

Answer 40

Técnica para distinguir secuencias ARN, post electroforesis se pasa del gel a membrana nitrocelulosa y se usa sonda con bases complementarias para que marque la secuencia de interés.

Question 41

¿Cuáles son las 3 formas de romper las membranas de una célula?

Answer 41

Homogenizado
Hirviendo
Sonicación

Question 42

¿Para qué sirve el mercaptoetanol y SDS?

Answer 42

Para que las proteínas antes de la electroforesis estén en condiciones denaturantes y reductoras.

• SDS: añade cargas negativas a toda la muestra, carga neta ya no es un factor de la migración.
• Mercaptoetanol: reductor de puentes disulfuro, los que mantienen la estructura terciaria de una proteína. Forma proteína no afectará en migración

Question 43

Mecanismo fraccionamiento subcelular

Answer 43

1) Homogenización para romper membranas y dejar organelos libres
2) En base a sedimentación diferencial, centrifugar a distintas velocidades
3) Baja primero lo más pesado (núcleos)
4) Baja último lo más liviano (virus y ribosomas)

Question 44

Mecanismo ensayo de pulso y caza

Answer 44

Seguimiento a proteínas en su ruta exocítica, desde que son sintetizadas hasta exocitosis.
1) Las células se incuban con un precursor radiactivo L-leucina-3H que es un aminoácido marcado
radioactivamente
2) Las células se incuban durante 3 min con el aminoácido marcado y se lava. El lavado es para remover todo lo que no fue incorporado en las células.
3) Se detecta la radioactividad incorporada en las células en el tiempo