Buisine 6 Flashcards
De quoi a-t-on besoin pour un séquençage par méthode de Sanger?
◦ ADN: fragment d’ADN amplifié
◦ Amorce: oligonucléotide
◦ Désoxyribonucléotides (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)→ ptite qtté de dNTP marqués par un fluorochrome
◦ 1% de DIDESOXYRIBONUCLEOTIDES (ddATP, ddGTP, etc.) (-)
◦ Poly: Taq ADN poly
◦ Solution tampon
Processus du séquençage par méthode de Sanger?
• Termocycleur:
1. Dénaturation de l’ADN (95°C)
2. Hybridation de l’amorce (50-55°C)
3. Elongation par la Taq poly 60-70°C
• Séparation des fragments par électrophorèse en gel de polyacrylamide (séquenceur d’ADN)
Que sont les nouvelles techniques de séquençage NGS?
- après 2005
- Séquençage simultané d’un très grand nombre de fragments d’ADN (plusieurs millions en qqes h) = séquençage haut débit
- Innovations technologiques: enzymes modifiées…
Quelles sont les applications des techniques de séquençage?
- Analyses génomiques: séquençage de qqes gènes, de tout l’exome ou du génome complet
- Analyses transcriptomiques: séquençage des ARNm, ARN non codants
- Analyse de modifications épigénétiques: séquençage de l’ADN méthylé, des domaines d’interaction…
Quels sont les avantages des techniques de séquençage?
- Séquençage simultané d’un très grand nbr de fragments d’ADN
- Grande sensibilité de détection
- Capacité à détecter des variations de séquence et des anomalies structurales
- Temps d’analyse de + en + court
- Coût de + en + faible
Quelles sont les limites des techniques de séquençage?
- Qtté de données +++→ problèmes pour le traitement et le stockage, interprétation: informatique, (bio)informatique
- Problèmes éthiques…
Quel est le gène en cause de la mucoviscidose?
gène CFTR
• Chr 7, 27 exons
• → protéine CFTR (1480 AA)→ canal Cl⁻
Quelle est la mutation la plus fréquence en cause de la mucoviscidose?
Mutation delta F508
• Délétion de 3 nt dans l’exon 10
• → délétion d’une phénylalanine en position 508
Comment recherche-t-on la mutation delta F508?
Amplification par PCR et analyse par électrophorèse en gel de polyacrylamide
En quoi consiste la recherche des mutations fréquentes par ARMS ou ASA?
= amplification spécifique d’allèle
• PCR à l’aide d’amorces spécifiques d’allèles (séquence normale/mutée) et analyse par électrophorèse
Quel gène est en cause de l’hémochromatose?
gène HFE
• localisé sur chr 6, contient 6 exons
• → prot HFE (348 AA): rôle dans la réguation de l’absorption du fer
• défaut de la protéine→ accumulation de fer dans les tissus
• → douleurs articulaires et abdominales, diabète, fibrose hépatique
Quelle est la mutation la + fréquence en cause de l’hémochromatose?
mutation C282Y
• Substitution G→ A dans l’exon 4
Comment se passe la recherche de la mutation C282Y?
Recherche de cette mutation par PCR-RFLP
• La mutation fait apparaître un nouveau site de restriction enzymatique pour l’endonucléase de restriction Rsa1
Quelles sont les applications du typage génétique par analyse de microsatellites?
DNP (contamination maternelle), tests de paternité, analyses médico-légales…
Quel est le principe du typage génétique par analyse de microsatellites?
- Analyses de microsatellites polymorphes
* Amplification par PCR et électrophorèse en gel de polyacrylamide