9. espressione genica

Question 1

Dove è contenuta l’informazione ereditabile?

Answer 1

Nella sequenza lineare dei nucleotidi nel DNA.

Question 2

Esperimenti di Beadle e Tatum (1941)

Answer 2

Ipotesi: un gene, un enzima (one gene-one enzyme), cioè i geni agiscono tramite la produzione di enzimi e un gene specifico codifica un enzima specifico che interessa uno specifico passaggio di una via metabolica.

Esperimento sulla muffa Neurospora crassa: analizzarono circa 100.000 spore irradiate (esposizione a raggi X per produrre mutazioni genetiche) e isolarono le mutanti. Videro che ogni mutante mancava di uno specifico enzima, mancanza che impediva una specifica reazione metabolica.

Question 3

Scoperta di Pauling (1949) e Ingram (1956)

Answer 3

“Sickle cell anemia, a molecular disease” (1949), prima dimostrazione che una malattia umana è una causata dalla presenza di una proteina anomala: l’emoglobina nei globuli rossi dell’anemia falciforme è anomala → problema molecolare, ‘malattia molecolare’.

La mutazione in un singolo gene causa la sostituzione dell’acido glutammico (amminoacido polare carico) con la valina (aa apolare), che porta alla formazione di eritrociti falciformi.

Scoperta: una mutazione genetica provoca una variazione della sequenza amminoacidica.
→ la sequenza lineare dei nucleotidi in un segmento di DNA determina la sequenza amminoacidica della proteina corrispondente.

Question 4

RNA

Answer 4

Acido ribonucleico.

Polimero di ribonucleotidi legati 3’-5’ (gruppo fosfato legato al C5 di un nucleotide lega con il C3 del nucleotide adiacente).

Costituito da un solo filamento, con polarità di direzione 5’-3’.
Però può ripiegarsi su se stesso, tramite legami idrogeno, grazie alla complementarietà delle basi: l’uracile lega con l’adenina tramite due legami idrogeno.
Diversamente dal DNA, può assumere moltissime conformazioni diverse e perciò svolgere ruoli molto diversi (binomio struttura-funzione).

Question 5

Ribonucleotide

Answer 5

Monomero dell’RNA.
Ribosio, gruppo fosfato legato a C5, base azotata legata a C1.

Basi azotate per il ribosio
Pirimidine: U, C
Purine: A, G

Question 6

Esiste un tipo solo di RNA?

Answer 6

No, esistono diversi tipi di RNA.

• mRNA, codificano le proteine
• rRNA, formano il nucleo dei ribosomi, catalizzano la sintesi di proteine
• tRNA, adattatori che mediano il legame dei nucleotidi all’mRNA
• miRNA, micro RNA, regolano l’espressione genica negli eucarioti intervenendo tra la trascrizione e la traduzione (possono bloccare la traduzione di un mRNA, non rendendolo accessibile al ribosoma, per silenziare un gene)
• altri piccoli RNA

Question 7

Cistrone

Answer 7

Unità genetica più piccola che codifica un solo peptide.

Question 8

miRNA

Answer 8

micro RNA
Classe di RNA regolatrice, non codificante.
Intervengono tra la trascrizione e la traduzione.
Si legano all’mRNA per impedire il suo accesso al ribosoma per la traduzione e cioè per silenziare un gene.

Question 9

“Dogma” centrale della biologia molecolare (Crick, 1956)

Answer 9

Il flusso dell’informazione genetica è monodirezionale.

Il DNA può replicarsi tramite la DNA polimerasi.
L’informazione codificata nelle sequenze di DNA viene trasferita in molecole di RNA dalla RNA polimerasi.
L’informazione contenuta nelle molecole di RNA passa nelle proteine, grazie ai ribosomi.

Question 10

Gene

Answer 10

Unità funzionale del DNA.

Sequenza di nucleotidi che agisce da unità funzionale per la produzione di una proteina: un gene, una proteina.

La sequenza lineare dei nucleotidi in un segmento di DNA determina la struttura primaria degli amminoacidi della proteina corrispondente.

L’informazione della doppia elica di DNA è organizzata in geni.

Question 11

Una stessa sequenza di DNA può portare alla formazione di proteine diverse a seconda della cellula?

Answer 11

Sì, perché dipende dall’espressione genica.

Question 12

Trascrizione

Answer 12

Sintesi di RNA sullo stampo di DNA allo scopo di rendere utilizzabile dalla cellula l’informazione contenuta nel DNA.

La sequenza di RNA risultante è complementare a quella di DNA che fa da stampo, e perciò identica a quella che non fa da stampo (con T=U).

Question 13

Quante molecole di RNA possono essere trascritte per un solo gene?

Answer 13

Una o più, dipende dalla regolazione genica.
Se serve una grande quantità della proteina derivante da quel gene, allora saranno trascritte molte molecole di RNA: un singolo gene può essere trascritto simultaneamente da più RNA polimerasi che si susseguono sul filamento stampo.

Question 14

La trascrizione avviene nello stesso modo per procarioti ed eucarioti?

Answer 14

No.
- I procarioti hanno una sola RNA polimerasi, mentre negli eucarioti la maggior parte degli RNA è sintetizzata dalle tre RNA polimerasi nucleari (I → rRNA, II → mRNA e miRNA, III → tRNA e un rRNA), ma ci sono anche una RNA polimerasi mitocondriale e una cloroplastica.
- Le RNA polimerasi eucariotiche non riconoscono immediatamente il promotore, necessitano di un gruppo di proteine (fattori generali di trascrizione), con cui formano il complesso di inizio della trascrizione.
- Il controllo dell’espressione genica eucariotico è molto più complesso (gli eucarioti hanno un numero di geni molto più elevato dei procarioti): lunghi tratti di DNA non codificano, bensì regolano l’espressione genica.
- La terminazione è totalmente diversa: nei procarioti l’RNA polimerasi interrompe la trascrizione alla fine della sequenza di terminazione e rilascia l’RNA; negli eucarioti, invece, continua ad aggiungere nucleotidi dopo la sequenza di terminazione fino a trascrivere il segnale di poliadenilazione che viene recepito da un enzima che taglia l’RNA.

Question 15

Come avviene la trascrizione nei procarioti?

Answer 15

INIZIO
La RNA polimerasi si associa a un fattore proteico σ che aumenta l’affinità della RNA polimerasi per il promotore.
All’estremità 3’ del gene si trova il promotore (sito iniziatore) con il TATA box (tratto ricco di TA); il promotore non viene trascritto né tradotto.
Il promotore orienta la RNA polimerasi sul filamento 3’-5’ di DNA, in modo tale che essa sintetizzi in direzione 5’-3’. Però, entrambi i filamenti di DNA possono fare da stampo, ognuno in una orientazione, MA per un gene esiste un solo promotore che si trova in uno dei due filamenti.
All’interno (in genere all’estremità) del promotore si trova il sito di inizio, ovvero il punto in cui inizia la trascrizione.
La RNA polimerasi srotola il DNA, rilascia il fattore σ e inizia la sintesi dell’RNA.

ALLUNGAMENTO
Nella regione ibrida (DNA-RNA, circa 12 bp), la RNA polimerasi aggiunge all’estremità 3’ della molecola di RNA nucleosidi trifosfato: dalla rottura del legame fosfoanidride si ricava l’energia per il legame fosfodiesterico tra i nucleotidi.
Mano a mano che la RNA polimerasi procede, riavvolge il DNA trascritto.

TERMINAZIONE
L’RNA polimerasi riconosce una sequenza di terminazione, ricca in G e C, che induce l’RNA neosintetizzato a ripiegarsi a forcina grazie ai tripli legami idrogeno tra G e C.
Dopo la regione a forcina, si trova una sequenza di poliU (UUUU), ovvero una sequena di poliA sul DNA. Il legame AU è il più debole, per cui è favorito il distacco dell’mRNA e della RNA polimerasi dal DNA.

Question 16

L’RNA polimerasi ha attività esonucleasica?

Answer 16

No, quindi nella trascrizione ci sono molti più errori di quanti ce ne siano durante la replicazione del DNA (1 errore ogni 10^5 nucleotidi vs 1 errore ogni 10^9 bp).

Errori della RNA polimerasi sono meno gravi, perché un errore nel DNA si propaga in tutte le cellule figlie.

Question 17

Come avviene la trascrizione negli eucarioti?

Answer 17

INIZIO
I fattori generali di trascrizione della RNA polimerasi II (TFII) individuano il promotore, aprono la doppia elica di DNA attivano la RNA polimerasi, assieme alla quale formano il complesso di inizio della trascrizione, e la fanno legare al promotore: il primo fattore generale di trascrizione TFIID contiene la subunità TBP (TATA binding protein) che si lega al TATA box.
Una volta che l’RNA polimerasi è legata, uno dei fattori generali di trascrizione assume attività chinasica, operando la fosforilazione della coda della RNA polimerasi. La fosforilazione sgancia i fattori generali di trascrizione, che sono disponibili per un nuovo ciclo, e dà inizio all’attività di sintesi.

ALLUNGAMENTO
L’RNA polimerasi svolge il DNA e allunga mano a mano il trascritto in RNA aggiungendo nucleosidi trifosfato in direzione 5’-3’.

TERMINAZIONE
La RNA polimerasi riconosce la sequenza di terminazione, trascrive in RNA la sequenza di DNA che codifica un segnale di poliadenilazione (AAUAAA), che viene recepito da un enzima che taglia l’RNA.
L’RNA polimerasi si stacca dal DNA e viene defosforilata, così da poter iniziare un altro ciclo di trascrizione.

Question 18

L’RNA risultante dalla trascrizione è subito utilizzabile?

Answer 18

No, il trascritto primario di qualunque tipo di RNA va in contro a maturazione: rimozione di alcune regioni e/o modificazione di alcuni nucleotidi.
L’insieme di questi processi è detto modificazioni post-trascrizionali.

La maturazione di rRNA e tRNA è simile in procarioti ed eucarioti, quella dell’mRNA è diversa.

Question 19

Maturazione degli rRNA

Answer 19

4 tipi di rRNA negli eucarioti: 28S, 18S, 5,8S, 5S.
I primi tre sono codificati da un’unica unità di trascrizione, trascritta nel nucleolo da RNA polimerasi I in un unico trascritto primario da 45S, detto pre-rRNA.
Nell’unità di trascrizione, i geni per i singoli rRNA sono separati da spaziatori trascritti; e nel genoma, le molteplici copie di unità di trascrizione sono separate da spaziatori non trascritti.
Sempre nel nucleolo, il pre-rRNA 45S è sottoposto a maturazione:
- modificazioni chimiche (metilazione del ribosio, modificazione dell’uridina in pseudouridina)
- numerose reazioni di taglio per la rimozione degli spaziatori trascritti.
Alla fine del processo, si ottengono i tre rRNA maturi 28S, 18S e 5,8S.

L’rRNA 5S, invece, viene trascritto dall’RNA polimerasi III ed è sintetizzato già in forma matura da geni non nel nucleolo. Una volta sintetizzato, diffonde nel nucleolo e si associa con gli rRNA 28S e 5,8S e con le proteine ribosomiali a formare la subunità ribosomiale maggiore.
Mentre il 18S forma con altre proteine ribosomiale la subunità ribosomiale minore.

Question 20

Maturazione dei tRNA

Answer 20

I vari tipi di tRNA sono sintetizzati dall’RNA polimerasi III e la loro maturazione avviene nel nucleo.
Tutti i tRNA si ripiegano a trifoglio, grazie alla complementarietà delle basi, struttura che ha uno stelo, contenente le due estremità della molecola a cui si legherà l’amminoacido specifico, e tre anse.
Il pre-tRNA è più grande del tRNA maturo. Infatti, la maturazione implica:
- rimozione di alcune sequenze, tra cui la sequenza leader (all’estremità 5’) e la sequenza all’estremità 3’
- aggiunta del trinucleotide CCA all’estremità 3’
- modificazione chimica del 10-15% dei nucleotidi con metilazioni o formazioni di basi insolite

Question 21

Maturazione degli mRNA

Answer 21

Avviene nel nucleo, così come la loro sintesi, e li prepara a essere trasportati nel citoplasma e lì tradotti dai ribosomi.

Cappuccio al 5’
Inizia durante la trascrizione con l’aggiunta di un cappuccio al 5’ costituito dal nucleotide 7-metilguanosina, che si lega al pre-mRNA attraverso 3 gruppi fosfato mediante un legame 5’-5’ (la 7-metilguanosina è in orientamento opposto rispetto al pre-mRNA). Tale cappuccio protegge l’mRNA dalla degradazione da parte di alcune esonucleasi.

Splicing
Lo splicing consiste nella rimozione degli introni e nell’unione degli esoni al fine di ottenere un mRNA continuo che codifichi la proteina.
Può avvenire durante o subito dopo la trascrizione.
Gli introni sono delimitati da una sequenza GU all’estremità 5’ e da una AG all’estremità 3’.
Una snRNP si lega alla sequenza GU, un’altra a una desossiadenosina (dAMP, A) e le due snRNPs si avvicinano, spingendo l’introne a formare un’ansa.
A quel punto avviene l’assemblaggio dello spliceosoma, a cui seguono la formazione del cappio e il taglio dell’introne al 5’.
A quel punto lo spliceosoma taglia anche l’estremità 3’ dell’introne e avvicina le estremità 3’ e 5’ degli esoni, saldandole insieme.
La sequenza intronica verrà successivamente degradata nel nucleo.

Poliadenilazione
Aggiunta di una coda di poli(A) all’estremità 3’ del trascritto primario di mRNA, vicino al quale si trova il segnale di poliadenilazione, costituito da una sequenza di basi AAUAAA.
La poliadenilazione facilita l’esportazione dell’mRNA maturo fuori dal nucleo, poiché la coda di poli(A) viene riconosciuta da specifiche proteine; protegge l’mRNA dalla degradazione; favorisce l’inizio della traduzione poiché facilita il riconoscimento dell’mRNA da parte dei ribosomi.

Question 22

Differenza tra mRNA procarioti ed eucarioti

Answer 22

Gli mRNA procarioti sono spesso policistronici: quando è necessaria l’attivazione di una certa via metabolica, tutti i geni coinvolti vengono trascritti in maniera consecutiva in un unico mRNA, che viene poi tradotto nelle varie proteine.
Inoltre, gli mRNA procarioti non necessitano di maturazione, ma vengono tradotti immediatamente.

Question 23

Splicing

Answer 23

(taglio e ricucitura)

Dai geni eucariotici vengono trascritte sequenze codificanti, dette esoni (exon, expressed region, sequenze espresse), e sequenze non codificanti, dette introni (intron, intragenic region, sequenze interposte). La lunghezza totale degli introni è in genere maggiore di quella degli esoni.

Lo splicing consiste nella rimozione degli introni e nell’unione degli esoni al fine di ottenere un mRNA continuo che codifichi la proteina.
Può avvenire durante o subito dopo la trascrizione.

Gli introni sono delimitati da una sequenza GU all’estremità 5’ e da una AG all’estremità 3’.
Una snRNP si lega alla sequenza GU, un’altra a una desossiadenosina (dAMP, A) e le due snRNPs si avvicinano, spingendo l’introne a formare un’ansa.
A quel punto avviene l’assemblaggio dello spliceosoma, a cui seguono la formazione del cappio e il taglio dell’introne al 5’.
A quel punto lo spliceosoma taglia anche l’estremità 3’ dell’introne e avvicina le estremità 3’ e 5’ degli esoni, saldandole insieme.
La sequenza intronica verrà successivamente degradata nel nucleo.

Question 24

Spliceosoma

Answer 24

Aggregato di 5 snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins, piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari), a loro volta formate da specifiche proteine e snRNA (small nuclear RNA, piccoli RNA nucleari).

Si occupa della catalizzazione dello splicing dell’mRNA. In particolare, sono gli snRNA a catalizzare il taglio degli introni e la saldatura degli esoni.

Question 25

Introne

Answer 25

(INTRagenic regiON)
Sequenza del DNA eucariotico, che viene trascritta in pre-mRNA e poi rimossa nella maturazione di quest’ultimo in mRNA maturo.

Sequenza altamente variabile, tranne che per GU all’estremità 5’ e AG all’estremità 3’.

I procarioti non hanno introni.

Question 26

Splicing alternativo

Answer 26

Permette di ottenere mRNA maturi differenti, e dunque proteine differenti, a partire da un unico gene.
Gli esoni del pre-mRNA vengono combinati in maniera differente per ottenere mRNA differenti, poiché i siti di splicing (alle estremità degli introni) possono essere attivati o ignorati in base a segnali di proteine regolatrici.

Ciò consente un aumento significativo del potenziale di codificazione del genoma, ovvero il numero di proteine diverse che un organismo può produrre è molto maggiore al numero di geni.
Un unico gene, in cellule diverse, porta alla produzione di proteine diverse, dette isoforme.

Question 27

Isoforme proteiche

Answer 27

Proteine diverse derivanti da uno stesso gene, che si ottengono grazie allo splicing alternativo.

Question 28

Correlazione tra dimensioni del genoma e complessità dell’organismo

Answer 28

Non c’è una correlazione tra i due.
Tuttavia, il DNA non codificante aumenta all’aumentare della complessità dell’organismo.
Solamente il 2% del genoma umano codifica per proteine (in altre specie è molto diverso). La maggior parte dei geni dei mammiferi codifica non per proteine ma dà origine a molecole di RNA che hanno un ruolo regolatorio nell’espressione genica.

Question 29

I procarioti hanno introni?

Answer 29

No.
Ipotesi:
- le cellule eucariotiche hanno acquisito gli introni come materiale genetico invasivo
- le cellule primitive avevano introni e i procarioti li hanno eliminati per aumentare l’efficienza delle replicazione ed espressione geniche.

Question 30

Mondo a RNA

Answer 30

Ipotesi secondo la quale l’RNA è la prima molecola originatasi sulla Terra, che conteneva l’informazione genetica, ed era in grado di replicarsi tramite il meccanismo a stampo, e svolgeva le funzioni catalitiche, adottando conformazioni tridimensionali particolari (ribozimi).
I ribosomi e gli spliceosomi, entrambi formati di RNA, sono una prova di ciò.

Inoltre, l’RNA è chimicamente più semplice del DNA, in quanto il ribosio si può formare dal ‘brodo primitivo’, mentre il desossiribosio necessita di enzimi specifici per la sua sintesi; il ribosio è anche più instabile del desossiribosio (il gruppo H è più reattivo dell’OH), per cui può partecipare a più reazioni.

Successivamente, l’RNA si è evoluto per la sintesi di proteine, che hanno sostituito l’RNA come molecole funzionali delle cellule (più reattive e più capacità catalitiche). Da queste, si sono evoluti enzimi in grado di sintetizzare DNA e creare copie di RNA da esso. Così il DNA ha sostituito l’RNA come molecola contenente l’informazione genetica.