8. duplicazione del DNA Flashcards
DNA polimerasi
Enzima che catalizza la polimerizzazione del filamento di DNA.
Sintetizza il nuovo filamento di DNA assemblando desossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) in maniera complementare al filamento stampo.
Nei procarioti, DNA polimerasi (I, II, III, IV, V)
Negli eucarioti, DNA polimerasi (α, β, γ, δ, ε)
Qual è la struttura della DNA polimerasi?
Molecola multimerica (ha più domini).
Il sito catalitico si lega alle bp (base pairs) tramite legami idrogeno.
Come avviene la sintesi del nuovo filamento 5’-3’ di DNA?
La sintesi avviene a partire da bolle di replicazione in modo bidirezionale (4 nuovi filamenti).
A partire dal filamento stampo, la DNA polimerasi assembla desossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) in direzione 5’-3’, liberando pirofosfato (P2O7(4-)).
La liberazione di pirofosfato fornisce l’energia necessaria per far avvenire la reazione.
Il filamento 5’-3’ viene sintetizzato in maniera continua ed è detto filamento guida.
Come avviene la sintesi del filamento 3’-5’ di DNA?
La DNA polimerasi sintetizza solo in direzione 5’-3’. Quindi il filamento 3’-5’, detto filamento lento, viene sintetizzato in frammenti di Okazaki.
La DNA polimerasi aggiunge nucleotidi al primer a RNA sintetizzato dalla DNA primasi fino a completare il frammento di Okazaki. Poi procede ad allungare il successivo innesco a RNA.
La nucleasi rimuove gli inneschi a RNA.
La DNA polimerasi I sintetizza i tratti di DNA mancante, dove prima si trovavano gli inneschi.
La DNA ligasi unisce il nuovo frammento di Okazaki al resto del filamento in sintesi.
Si pensa che il filamento lento si ripieghi ad ansa per facilitare l’interazione di tutti i componenti della macchina replicativa.
Quali sono le due attività enzimatiche della DNA polimerasi?
- attività polimerasica in direzione 5’-3’: lega il nucleotide con la base azotata che si appaia correttamente con il filamento stampo
- attività esonucleasica in direzione 3’-5’: sistema di autocorrezione degli errori che consente di rimuovere un nucleotide erroneamente appaiato prima di aggiungere il nucleotide successivo
Come funziona l’autocorrezione della DNA polimerasi?
L’attività esonucleasica della DNA polimerasi consente di rimuovere un nucleotide erroneamente appaiato prima di aggiungere il nucleotide successivo.
La DNA polimerasi, nell’aggiunta di nucleotidi, compie 1/10^5 errore di appaiamento.
La sua attività esonucleasica riduce l’errore a 1/10^9 coppie di nucleotidi.
DNA polimerasi aggiunge un desossiribonucleoside trifosfato errato al filamento che sta sintetizzando, liberando un pirofosfato.
Rimuove il nucleotide appena aggiunto, così da avere il terminale 3’ nuovamente pronto per l’aggiunta del nucleotide corretto.
La polimerizzazione è resa energeticamente possibile dall’idrolisi del legame fosfo-anidridico (che lega tra loro i gruppi fosfato), che è un legame ad alta energia.
La DNA polimerasi inizia la sintesi di DNA?
No, è solo in grado di allungare una catena preesistente, aggiungendo nucleotidi alla sua estremità 3’.
La sintesi inizia con un breve tratto di RNA, detto primer o innesco, sintetizzato dall’RNA polimerasi detta DNA primasi.
Qual è la velocità della replicazione del DNA?
Il DNA si può replicare a 1000 nucleotidi al secondo.
Che significa che la replicazione del DNA è semiconservativa?
Ogni doppia elica figlia è formata da un’elica vecchia e una nuova.
Esperimento di Meselson e Stahl (1958)
Ipotesi: la replicazione del DNA è semmiconservativa.
Usarono diverse generazioni di batteri fatte crescere in terreni contenenti uno N14 (azoto “leggero”) e l’altro N15 (azoto “pesante”).
Isolarono il DNA delle varie generazioni, lo centrifugarono e videro le posizioni del DNA “leggero” e di quello “pesante” all’interno della provetta.
Conclusione: l’ipotesi è confermata.
Esperimento di Cairns (1963)
Mediante isotopi radioattivi e la tecnica dell’autoradiografia, dimostra che la replicazione del DNA circolare batterico (del batterio E. Coli) ha inizio in corrispondenza dell’origine di replicazione, dove si apre la bolla di replicazione e da cui procede la replicazione in maniera bidirezionale dalle forcelle di replicazione.
Esperimenti di Taylor, Woods e Hughes (1957)
Offrono la prova sperimentale che anche la replicazione negli eucarioti è semiconservativa.
Prima replicazione con Timidina triziata (marcata con trizio, isotopo radioattivo dell’H): i due cromatidi sono formati entrambi da un filamento caldo (radioattivo) e uno freddo.
Seconda replicazione senza Timidina triziata: i due cromatidi sono uno con entrambi i filamenti caldi e l’altro con entrambi i filamenti freddi.
Origine di replicazione nei procarioti e negli eucarioti
Procarioti
1 origine di replicazione
1 replicone (o unità di replicazione)
-> la replicazione del DNA inizia a livello dell’unica origine di replicazione e giunge al termine quando le due forcelle di replicazione si incontrano.
Eucarioti
Più origini di replicazione
10^4-10^5 repliconi per genoma
Come inizia la replicazione del DNA?
Le proteine iniziatrici si legano al DNA nei siti ricchi in AT (perché queste basi sono legate da due legami idrogeno invece che tre e quindi sono più facili da separare).
La DNA elicasi, consumando ATP, separa i due filamenti, aprendo la bolla di replicazione con le due forcelle di replicazione.
Il procedere della forcella di replicazione, però, causa il superavvolgimento del DNA per tensione torsionale.
Le topoisomerasi rompono transitoriamente un filamento, rilassano la torsione e infine risaldano il filamento.
Come funziona la topoisomerasi?
Il gruppo ossidrilico della tirosina della topoisomerasi forma un legame fosfodiestere con un fosfato di uno dei due filamenti di DNA, tagliando il filamento.
Il filamento tagliato ruota attorno all’altro.
L’energia del legame fosfodiestere originario è immagazzinata nel legame Tyr-fosfato, rendendo il taglio reversibile.
Alla fine, si riforma spontaneamente il legame fosfodiestere che permette alla topoisomerasi di staccarsi e alla doppia elica di rigenerarsi.
