5a. microscopia e frazionamento cellulare

Question 1

Microscopio ottico

Answer 1

A fotoni: la luce visibile attraversa il campione e poi un sistema di lenti (obiettivo e oculare) e viene deviata prima che raggiunga l’osservatore, a cui restituisce un’immagine ingrandita del campione.
Limite di risoluzione: 0,2 μm -> cellule e organelli più grandi (mitocondri e nucleo).
Ingrandimento: fino a 1000x.

Per evidenziare le strutture interne, aumentare il contrasto. Tecniche:
- contrasto di fase, evidenzia le differenze di densità (spermatozoi)
- a fluorescenza, campione colorato con sostanze fluorescenti
- confocale, usato per vedere la struttura tridimensionale

Question 2

Microscopio elettronico

Answer 2

Utilizza un fascio di elettroni che attraversa il campione e viene deviato dalle lenti, in modo tale da ottenere un ingrandimento dell’immagine.
Limite di risoluzione: 0,2 nm.
Ingrandimento: fino a 1Mx
2 tipi:
- SEM (microscopio elettronico a scansione): limite risolutivo di qualche centinaio di nm; il campione è rivestito da una sottile lamina metallica, una sonda scansiona il campione tramite un fascio di elettroni e restituisce uno stampo tridimensionale della superficie del campione in scala di grigi
- TEM (microscopio elettronico a trasmissione): limite di risoluzione più elevato; un fascio di elettroni attraversa il campione e restituisce un’immagine bidimensionale in scala di grigi

Question 3

Omogeneizzazione

Answer 3

Insieme di tecniche tramite cui la membrana plasmatica della cellula viene rotta (lisi cellulare), in modo tale che venga rilasciato il contenuto della cellula (organelli, molecole come enzimi, ribosomi, ecc.), in un succo denso detto omogenato o estratto.

Quattro procedure comuni:
- ultrasuoni: cellule rotte da ultrasuoni
- detergenti: viene usato un detergente per bucare la membrana
- pressione: le cellule vengono forzate con alta pressione attraverso una fessura e, nell’attraversarla, la membrana si rompe
- tritatura: le cellule vengono tritate in una provetta con un pestello rotante

Question 4

Centrifugazione frazionata

Answer 4

Tecnica di frazionamento cellulare che porta alla separazione delle componenti cellulari in base alle loro dimensioni e densità.
L’omogenato cellulare viene centrifugato a velocità progressivamente maggiori in modo da separare, a ogni centrifugazione, le componenti più grandi e dense, che subiscono maggiormente la forza centrifuga e sedimentano sul fondo della provetta, dalle componenti più piccole e meno dense che rimangono sospese nel surnatante, che viene centrifugato nuovamente finché tutte le componenti sono state separate.

Pellet 1: cellule, nuclei, citoscheletri
Pellet 2: mitocondri, lisosomi, perossisomi
Pellet 3: microsomi, altre vescicole di piccole dimensioni
Pellet 4: ribosomi, virus, macromolecole grandi

Question 5

Elettroforesi

Answer 5

Tecnica per separare le proteine in un gel in base alla loro dimensione in presenza di un campo elettrico.
Le proteine vengono ricoperte di cariche negative da un reagente (SDS) e poste sopra un gel (supporto semisolido) di poliacrilammide o amido.
Nella parte superiore del gel è posto un catodo e nella parte inferiore un anodo, in modo tale che le proteine (cariche negativamente) vengano respinte dal catodo e attratte dall’anodo, verso il basso. Si possono così individuare le proteine più grandi, ovvero più pesanti, poiché saranno quelle che scendono più velocemente.

Question 6

Come si studia la struttura terziaria di una proteina?

Answer 6

Cristallografia a raggi X

Question 7

Cristallografia a raggi X

Answer 7

Tecnica per studiare la struttura terziaria di una proteina.
Un fascio di raggi X colpisce il cristallo di proteina pura e la diffrazione dei raggi produce un’immagine (diffrattogramma).
Si ripete la procedura per piani successivi della molecola fino a ottenere diversi diffrattogrammi.
Da numero, posizione e intensità delle macchie si può dedurre la struttura terziaria della proteina.