2.7 Génie génétique à finir Flashcards
De manière générale, que doit-on faire pour travailler avec de l’ADN?
- **Couper l’ADN à des endroits précis: enzymes de restrictions
- Assemblage de fragment d’ADN: ADN ligase
- Amplification de l’ADN => clonage + PCR
- connaître la séquence d’ADN**
Quel est le rôle des enzymes de restriction?
coupent l’ADN à des endroits précis
quels sont les 2 types de coupes que les enzymes de restrictions font ?
- extrémité cohésive (sticky end): coupe de l’ADN qui résulte en un excès de bases, permettant ainsi d’insérer une séquence complémentaire pouvant se coller plus facilement à la séquence initiale
5’ T¦CGA 3’
—–
3’ AGC¦T 5’
- extrémité franche (blunt end): coupe de l’ADN verticale empêchant qu’il y ait des extrémités saillantes ou des séquences d’ADN non appariées
Quelles sont les enzymes de restrictions les plus utilisées ? quel est leur type de coupure et la site de coupe?
- Hae III: extrémité franche => GG¦CC
- EcoR1: extrémité cohésive => G¦AATTC
- Not1: extrémité cohésive=> GC¦GGCCGC
Combien de nucléotides contiennent les fragments coupés par ces différentes enzymes de restriction? Combien de combinaisons de fragments d’ADN sont possibles pour chaque enzyme ?
- Hae III: 4 nucléotides => 4^4 =256 combinaisons
- EcoR1: 6 nucléotides => 4^6= 4096 combinaisons
- Not1: 8 nucléotides => 4^8=65’536 combinaisons
Pourquoi dit-on que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction sont des palindromes?
parce qu’ils peuvent se lire dans les 2 sens selon le brin considéré
Qu’est-ce qu’un plasmique ? Quels sont les propriétés d’un plasmide?
- ce sont des minichromosomes circulaires
- utilisé comme vecteur
- peut se répliquer
- contient gène de résistance(aux antibiotiques ou autre)
- copies multiples dans une seule cellule
- **~4000 paires de nucléotides **
En quoi les plasmides sont des vecteurs pour l’ADN?
Car les plasmides sont transmissibles d’une bactérie à une autre ou à une autre cellule
Pour quel procédé essentiel de la recherche génétique les plasmides sont-ils essentiels?
permettent l’amplification d’ADN étranger (insertion)
Dans un milieu avec une certaine présence en antibiotiques, quelles bactéries réussiront à se reproduire?
Seules les bactéries possédant un gène de résistance dans leur plasmide pourront se multiplier
Quel est le site d’insertion d’ADN étranger dans la plasmide?
région polylinker dans le gène de Lacz
Comment se déroule la recombinaison d’ADN dans une séquence de plasmide?
- l’EcoR1 reconnaît sa séquence de reconnaissance, elle coupe l’ADN
- addition d’un fragment d’ADN étranger, les fragments se “collent” ensemble par appariement des bases (puisque l’ADN étranger a également été coupé par une EcoR1) 1 seule combinaison possible
- il y a des brèches entre les fragments => ADN ligase scelle les brèches par liaisons phosphodiester
RESULTAT: ADN recombiné
Quel est le processus pour cloner un gène ?
- isolé ADN plasmide et ADN humain
- insertion de l’ADN humain dans la plasmide (site polylinker): a. couper les deux séquences d’ADN avec l’aide de la même enzyme de restriction “EcoR1” (extrémité cohésive) b. mélange d’ADNs, ils s’apparient par complémentarité des bases c. ADN ligase forme liaison phosphodiester pour lier les fragments d’ADN
- insérer plasmide dans bactérie Lacz par transformation PAS TOUTES LES CELLULES SONT TRANSFORMéES SURTT CELLES à QUI ONT A INTRODUIT PLASMIDE
- culture de bactéries: on ajoute de l’antibiotique pour voir si elles survivent/grandissent, car si survivent cela veut dire qu’elles ont bien intégrer le plasmide (qui contient le gène de résistance à l’antibiotique)
- identification des clones ayant le gène intéressant
Quel est le processus le plus utilisé pour mettre le plasmide modifié dans la bactérie?
par électroporation
1. cellules électrocompétentes et plasmides sont incubés (dans cuvette spéciale)
2. un choc électrique est administré=> perméabilise la membrane temporairement
3. plasmides sont aspirées/rentrent dans la cellule/bactérie
4. puis la bactérie/ cellule redevient semi-perméable (pour cellule: ADN rentre dans noyau)
Comment être sûr que les bactéries qu’on observe ont toutes un plasmide avec le gène d’intérêt?
- après l’électroporation, on expose les bactéries à un antibiotique qui va tuer toutes les bactéries qui n’ont pas un gène de résistance, présent sur le même plasmide que le gène d’intérêt
- Les bactéries restantes après cette sélection possède le plasmide transformé
