Методи За Изследване На Макромолекули Flashcards
Основна идея на хроматографските методи
използва се свойството на белтъците да се свързват специфично с различни вещ. при фракционирането им от дадена смес
Хроматография същност
- използват се фази с различна консистенция
- неподвижна - тв. вещ(носител), различава се при методи - хартия, гранули, пластинки и др.
- подвижна - течност (разтворители или буфери)
Как става разделяне на белтъци от сместа
Разделяне на белтъци от сместа става чрез специфичното им взаимодействие с вещ. от неподвижната и подвижната фаза
Хроматографски методи
Хартиена
Тънкослойна
Колонна хроматография
Колонна хроматография същност
Неподвижна фаза - твърди гранули в цилиндрична колона с отвор долу
Смес от белтъци се наслоява върху гранулите, след това се пропуска течна фаза
-> придвижване на белтъчна смес по дължината на колоната
Отчитане на резултат колонна хроматография
- различни белтъци взаимодействат различно с гранули - преминават с различна скорост
- по-силно взаимодействие с носителя - забавяне, по-слабо - избързва
- белтъци достигат в определена последователност до дъното - събират се като отделни фракции
Афинитетна колонна хроматография (по сродство)
Използват се специфичини пространствени взаимодействия (антиген-антитяло, хормон-рецептор, ензим-субстратен аналог) между белтъци и повърхност на гранули в колоната
Къде се използва афинитетната колонна хроматография
В медико-биологични изследвания
Афинитетна колонна хроматография характеристика
- гранули свързани ковалентно с вещ., което специфично присъединява белтъка, който ще се отдели от сместа - използва се биологична активност на белтъка
- осигурява висока степен на пречистване, получаване на чисти проби ензими, хормони, антитела за медицински цели
Афинитетна колонна хроматография механизъм
1) Белтъчна смес пропусната през буферен разтвор
2) Белтъци от сместа с афинитет към лиганда се свързват с него
3) Белтъци без сродство към специфичната молекула се отделят
4) През колоната пропуснат буферен разтвор с променено pH - белтък се отделя от лиганда
5) Пречистен белтък
Електрофореза същност
- разделяне на белтъци в научни и клинични лаборатории
- белтъчни молекули с заредени R-групи - определят сумарен повърхностен заряд
- в ел. поле молекула се движи към единия от полюсите заради своя заряд, скорост зависи от големина на молекула и заряд
Гел електорфореза същност
- разделяне на белтъци на мембраната, на хроматина, на цитоскелета
- отделяне на специфични белязани с радиоактивен изотоп белтъци
- протича в определена последователност
Процес на гел електрофореза
1) Смес от белтъци в ямки на пластинка от гел (не взаимодейства с тях, но създава условия за придвижване)
2) Пластинка в буферен разтвор
3) Създава се ел. поле
4) Белтъци се движат от отрицателен към положителен полюс със скорост, зависеща от мол. масата им
Гел електорофореза резултат
Гел се изсушава, белтъци се отделят от гела и се получават в отделни фракции
(Използва се и при разделяне на фрагменти на ДНК)
Рекомбинантни ДНК технологии групи
1) Специфично разцепване на ДНК с рестриктази - улеснява отделяне на гени от ДНК
2) Определяне на нуклеотидна последователност ДНК фрагменти - определяне на границата на гена и АК, които кодира
3) Хибридизация на НК - откритие на специфична последователност на ДНК фрагмент
4) Клониране на ДНК - голям брой копия на ДНК фрагмент
