Western blot laboration Flashcards
Vilka kemikalier används för att det skall vara möjligt att separera proteiner efter storlek?
Vad gör kemikalierna?
DTT: Bryter disulfidbindingar, detta gör att de blir till sin primär struktur
SDS: Binder till proteiner med ett bestämt antal molekyler/aminosyra och gör dem negativit laddade. Effekten blir att laddning/massa blir konstant på proteinet. Oavsett hur stort proteiner är så kommer det att vandra lika fort i en lösning som man lagt en spädning över. De negativa molekylerna kommer vandra mot den positiva polen i SDS-PAGE
Vilken funktion har running buffert?
Används för att de ska finnas joner som bär strömmen , men också för att upprätthålla pH vid en relativt konstant värde
Vilka protein vandrar snabbast i gelen? Små eller stora?
Små de stora “fastar” i nätet. (Bis-akrylamid bildar tvärbryggor som förbinder polyakrylamid-kedjorna. Skapar ett nätverk som molekylerna måste ta sig igenom)
Vilken gas är de som ses när elektroforesen startar?
Syrgas och vätgas
Vad händer om man glömmer att stoppa SDS—PAGE elektroforesen efter angiven tid och låter den vara igång t.ex. två timmar istället för rekommenderade 60 minuter?
Vi kommer inte få någon separation eftersom allt kommer vandra ner
Varför används metanol/etanol som första steg när PVDF membranet prepareras före transfer?
PVDF membranet är super hydrofobt så när vi sköljer med metanol/etanol blir membranet mer hydrofilt vilket förbereder för vattenbehandling.
Vilken funktion har blocklösningen? Vad skulle hända om man inte inkuberade membranet i blocklösningen?
Detta förhindrar ospecifik inbindning genom att binda in till membranet, det förhindrar också en bakgrundsfärgning.
Varför är primär antikropp och sekundär antikroppar producerade i olika specis?
För att dem skall kunna binda till varandra, alltså för att vi senare skall få en visualisering. Kan inte den sekundär antikroppen binda in till den primära antikroppen kommer vi inte kunna detektera.
Antikroppar kan vara antingen polyklonala eller monoklonala. Vad menas med det? Vilka för och nackdelar finns med respektive antikroppstyp?
Monoklonal: bara specifik på en sak, binder till ett specfikt antigen
Polyklonala: blandning av antikroppar, som kan binda till flera olika antigen
Vad menas med kromogen detektion, chemoluminiscent detektion?
Kromogen detektion: färgmolekyler -> får produkt
Chemoluminiscent detektion: -> får ljus och produkt
Vad används Western Blot till?
Separera och identifiera proteiner i en mix av proteiner med hjälp av immunohistokemi.
Innan proteiner separeras med hjälp av gelelktrofores (SDS PAGE) måste provmatrialet prepareras. Hur går du till väga med en vävnad resp celler?
Vänad
Behöver brytas ned mekaniskt, exempel:
- Sonikering
- Homogenistering
Celler
Lyseras kemiskt dentergenter
Hur kan du extrahera proteiner efter dem provpreparerats inför gelelektroforesen (SDS-PAGE) ?
Exempel:
- Precipation
- Kromatografi
- Centrifugering
Vilka är stegen i western blot
- Prov matrail prepareras inför SDS-PAGE
- Proteiner extraheras från cellysatet/homogenatet
- Proteinerna separeras enligt molekylvikt i SDS-PAGE
- SDS och DTT tillsätts
- Proteiner transfereras till PVDF membran
- Immunohistokemi
- Detektion
Vad finns de för transfermetoder för att föra över proteiner till PVDF membran?
Exempel:
- Diffusion
- Vakum
- Semi torr
Vanligast är vätskebaserad elektroblottning
Hur fungerar vätskebaserad elektroblotting?
- Tanken fylls med transferbuffert innehållande metanol sim neutraliserar SDS.
- Gelen, membranet och ett filter papper läggs i kassett och förs ned i tanken
- Elektrisk spänning läggs över kasetten och proteinerna vandrar till den positiva anoden, från gelen till membranet som immobiliserar proteinet genom hydrofoba interaktioner.
Berätta om immunohistokemi
- Membran blockas för att undvika ospecifik inbindning av ointressant matrial
* Bovitin serum albumin eller mjölkpulver - Membran inkuberas i lösning med primärantikropp (antikroppen binder till epitoper på eftersökt protein)
- Membranet sköljs med PBS el TBS innehållande dentergenten Tween för att föhindra bakgrundsfärgning/ospecifik inbinding.
- Membran inkuberas i sekundär antikropp (detektionsantikropp)
- detektion
Får primär och sekundär antikropp ha samma specis? Varför varför inte?
Nej.
Primär antikropp ska uppvisa specifitet för protein som eftersöks (mus)
Sekundär antikropp måste vara anti-mus för att kunna binda in till primär antikropp
Vad händer om primär och sekundär antikropp har samma specis?
Sekundär antikropp kan ej binda in och vi får ingen detektion
Vilka former av detektionsantikropp finns de?
Vad är vanligast?
- Direkt konjugerad med ett enzym, fluorescent etc.
- Konjugerad med biotin som sedan binder till detektionskonjugerat streptavidin.
Vanligast är enzymkonjugerade antikroppar då man efter sköljning tillsätter substrat som enzymet kan konvertera till en färgad eller chemoluminiscent produkt.
Vad gör 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP) i analysen?
Konventerar detektionsantikropp till färgad produkt
Varför inkuberar du proverna på värmeblock?
Detta denaturerar proteinerna
Varför lägger du PVDF membranet i etanol innan transfer?
Pga att de är super hydrofobt?
Hur packar du din kassett inför elektroblotting?
Vad har hänt om din gel rullat ihop sig i mickron?
Den har vart där för länge eller på för hög värme
Du skall späda en antikropp 1:5000 och behöver 10 ml hur mycket ska du ta av antikropp resp lösning som dden ska lösas i?
Hur bereder du en transferbuffert som ska bli 1 L?
Du har detta:
Tris-base 3,03 g
Glycin 14,26 g
Metanol 200 ml
Tar allt x5
