LC-MS laboration Flashcards
Berätta om bakgrunden för PEth.
Vad betyder de?
Vad används de till?
Hur bildas de?
Vart i kroppen lagras de?
Varför använder man blod i analys?
Det står för fosfatidyletanol och är en alkoholmarkör som används för att skilja mellan låg,hög och måttlig alkoholkonsumption.
Det är en glycerolfosfolipid som normalt inte förekommer i kroppen men som bildas i närvaro av etanol. PEth bildas enzymatiskt från lipiden fosfatidylkolin och etanol via enzymet fosfolipas D. I frånvaro av etanol bildas istället fosfatidsyra.
PEth lagras in i cellmembranet hos röda blodkroppar och därför används helblod i analysen.
Är PEth en substans?
Nej! Fettsyra 1 och 2 kan förekomma i olika former (isomerer) vilket medför att PEth inte bara är en substans.
Vilken variant av PEth används för kvantifiering i analys?
PEth 16:0/18:0.
Fettsyra 1 är palmitinsyra 16:0
Fettsyra 2 är Oljesyra 18:1
(siffrorna anger anatalet kol atomer resp antalet dubbelbindingar)
Vad är indikationen för PEth analys?
Kontroll av alkoholkonsumtion/avhållsamhet från alkohol hos patienter inom bl.a. beroendevården och vid transplantationsuntredningar.
Vad är analysprincipen för PEth?
PEth analyseras i LC-MS-MS.
Masspektrometer med trippelquadropol. Negativ elektrospray (ES-) används som joniseringsmetod och multiple reaction monitoring (MRM) som insamlingsmetod.
Beskriv internstandarden som tillsätts proven, vad gör internstandarden?
En internstandard i metanol/aceton (50:50) tillsätts till helblod (prov taget i K2-EDTA-rör). Internstandarden är deuteriuminmärkt PEth 16:0/18:0-d5.
För att korrigera upparbetningsfel och analysfel tillsätts internstandard.
Hur kan ett prov innehållande internstandard skilja sig i resultat mot ett som inte gör de?
Internstandard används för att korrigera upparbetningsfel och analysfel vilket då medför en förbättring av analysen.
Provsvar skiljer sig eftersom vi med internstandard tar hänsyn till eventuell förlust vilket man inte gör när man inte använder internstandard.
Beskriv trippelquadrupolen i LC-MS-MS
- Molekyljonen för PEth 16:0/18:1 selekteras i den första kvadrupolen.
- Den fragmenteras sedan med argongas i den andra quadropolen.
- Från de bildade jonerna filtreras fragmentjonen från fettsyra 16:0 ut för att sedan detekteras.
Hur kalibreras analysen?
Analysen kalibreras genom att analysera sex koncentrationsnivåer av PEth 16:0/18:1 och skapa en kalibrerkurva som kan användas som referens.
Dessa prover kallas kalibranter och består av i förväg spikat PEth-fritt helblod som upparbetas på samma sätt som patientproverna.
Gå igenom labbens steg
:)
En gemensam fällningslösning ska beredas som ska räcka till hela gruppen.
Fällningslösningen ska bestå av internstandard (ca 0,2 μM) i metanol/aceton 1:1. Uppskatta hur mycket fällningslösning som behöver beredas (=300 μL/prov + några mL i överskott så att den säkert räcker till alla).
Totalt 21 prov
Stamlösning 100 μM
Hur kan du räkna ut dina inställningar på centrifugen?
Vad innehöll våran fällningslösning?
Metanol:Aceton 50:50 (lösningsmedel)
Internstandard
Ger ett enstaka berusningstillfälle (alkoholkoncentration 1-1,5 promille) upphov till den högst graden (missbruk)?
Vad är halveringstiden för PEth?
Hur långt tillbaka visar PEth alkoholkonsumption?
Kan en person som inte har alkoholproblem få värde i analysen?
Ett enstaka berusningstillfälle (alkoholkoncentration 1-1,5 promille) ger inte upphov till PEth-koncentration över 0,30 μmol/L, varken akut eller under efterföljande dygn.
Halveringstiden för PEth är cirka 4 dygn.
PEth visar främst alkoholkonsumtion under de senaste 2 veckorna.
Eftersom lägsta gräns satts till <0,03 μmol/L kan även en socialt accepterad alkoholkonsumtion ge ett numeriskt värde.
Hur bearbetar du dina värden ?
Beräkning utan internstandard:
1) Gör en lista över alla provers topparea för PEth 16:0/18:1 (kalibranter, DKer, patientprover från alla labbpar i gruppen).
2) Gör en lista över kalibranternas åsatta koncentrationer.
3) Sätt upp en kalibrerkurva där du plottar kalibranternas topparea för PEth 16:0/18:1 mot deras koncentration.
4) Lägg in en regressionslinje och ta fram linjens formel.
5) Räkna ut koncentrationen PEth 16:0/18:1 i driftkontroller och patientprover.
6) Kontrollera om driftkontrollerna blev godkända.
Beräkning med internstandard:
1) Gör en lista över alla provers topparea för internstandarden (kalibranter, DKer, patientprover från alla labbpar i gruppen).
2) Räkna ut kvoten mellan varje provs topparea för PEth 16:0/18:1 och internstandardarea.
3) Sätt upp en kalibrerkurva där du plottar kvoten för kalibranterna mot deras koncentration.
4) Lägg in en regressionslinje och ta fram linjens formel.
5) Räkna ut koncentrationen PEth 16:0/18:1 i driftkontroller och patientprover.
6) Kontrollera om driftkontrollerna blev godkända.
