Detektionsmetoder Flashcards
Ge exempel på specialiserade detektionsmetoder och vad dem traditionellt har använts tillsammans med?
Elektroninfångningsdetektion, flamjonisationsdetektiom och masspektrometri är tre specalicerade detektionsmetoder som traditionellt har använts tillsammans med gaskromatografi för att ge en hög selektivitet och hög känslighet.
Intressanta analyter är oftast utspädda med höga koncentrationer av ointressanta ämnen och analyter finns ofta i väldigt låga koncentrationer.
Hur hittar vi rätt molekyl i ett blodprov?
- Separation innan detektion-> kromatografi
- Detektion
- Känslig detektion -> ger en bra signal även vid låga koncentrationer
- Selektiv detektion -> kan skilja mellan två snarlika molekyler
Masspektrofotometri med vätskekromatografi är ett dominerande val idag.
(förr användes främst gaskromatografi tillsammans med elektroninfångningsdetektion, flamjonisationsdetektion eller masspektrofotometri)
Immunobaserade tekniker kan också generera metoder med hög känslighet och relativt hög selektiviter (har dock sina begränsningar)
Vad är vätskekromatografi ?
- Teknik som kan separera molekyler med hjälp av två-fassystem
- Kombineras vanligen med:
- UV-detektion
- fluorescensdetektion
- elektrokemisk detektion
- Masspektrometri
Kolonn innehåller fastfas (modifirade partiklar), med hjälp ab pump så pressas en mobilfas genom kolonnen. Mobilfasen kan bestå av en vattenbuffert och ett organiskt lösningsmedel som metanol eller acetronil.
Prov injiceras och fastnar på fastfasen, varpå den elueras med hjälp av mobilfasen och flöderar till detektorn.
Genom att kombinera olika fastfaser och mobilfaser kan man separera det ämne man är intresserad av ifrån andra ämnen i sitt prov.
Berätta om fastfasen i kolonnen.
- Vad är de vanligaste matrialet?*
- Kan separation påverkas ?*
- Vad är mottryck?*
- UPLC?*
Fastfasen består av : olika modifierade partiklar
Vanligtvis är de modifierade partiklarna modifierade så att de binder hydrofoba ämnen=> ämen fastnar om mobilfasen innehåller mycket vatten och lossnar om de innehåller mycket organiskt lösningsmedel. = reversed phase
Storleken på partiklarna i kolonnen avgör hur snabbt separationen kan utföras, ju mindre partiklar ju snabbare separation.
När partiklarna i kolonnen blir mindre ökar mottrycket. Är mottrycket högre än 400 Atm kallas de UPLC.
Berätta om gaskromatografi.
- Faser*
- Hur ska ämnena vara*
- kolonnen*
Lättflyktiga ämnen är till fördel för gaskromatografi. Ämnen som inte är lättflyktiga kan göras lättflyktiga genom derivatisering (man hänger på grupper som ändrar ämnets kemiska egenskaper).
- Man får en väldigt bra separation med gaskromatografi
- Kan sedan kombineras med flera olika detektorer
- Masspektrometri
- Elektroninfångningsdetektion
- flamjonisationsdetektion
Använder 2 faser, mobilfas är en gas (vanligen helium) som flödar genom kolonn. Stationär fas återfinns i kolonn som en film som intragerar med ämnena i provet.
Kolonnen hänger i en ugn, när man ökar temp så eluerar ämnen loss ifrån filmen och följer med till detektorn.
Vad är elektroninfångningsdetektion?
Några ämnen som ger isärklass högst signal?
Är detektionsmetoden selektiv?
Detektionsmetod som är selektiv för en förenings elektronnegativitet (dess förmåga att attrahera en elektron).
Fluor, klor och brom ger hög signal. Eftersom dessa ämen ger en såpass hög signal kan detektionsmetoden ses som selektiv
Beskriv elektroninfångningsdetektorn
Har en radioaktivkälla som avger elektroner i form av betapartiklar. Betapartiklarna joniserar gas i detektorn. Detta skapar ett moln av elektroner vilket genererar elektronström genom att spänning läggs på. Detektorn försöker hålla strömmen konstans genom att ändra spänningen som läggs på.
När ett ämne som är elektronnegativt kommer in i detektorn så attraheras elektroner i från elektronmolnet och de finns då färre elektroner tillgängliga och spänningen som läggs på får ändras (antal pulser ökar), detta kan då omvandlas till mätsignal.
Beskriv flamjonisationsdetektion
- Absolut vanligaste detektorn
Selektiv för föreningar som innehåller kol.
Används för att analysera flyktiga lösningsmedel, är inte lämplig inom biokemi då alla biomolekyler innehåller mycket kol.
Bärgasen innehållande analyterna blandas med vätgas och förbränns. Joner bildas under förbräningen och negativa joner attraheras till en elektrod där de bildar en ström. Strömmen mäts och används för att generera mätsignal
Vad är masspektrometri?
- Samling av olika tekniker som analyserar joner som befinner sig i gasfas.
Vad är en masspektrometer?
- Producerar joner i gasfas från ett prov som är i fast fas, lösning eller gas fas.
- Sorterar joner utifrån dess massa till laddningskvot m/z
- Ger signal som är propitionell mot mängden bildade joner av varje ämne
Instrumentet sorterar laddade partiklar med elektromagnetiska fält genom att partikelstrålarna böjs av olika mycket beroende på partiklarnas massa (lättare joner påverkas i högre utsträckning än tyngre joner, och böjs därför av mera). Jonerna identifieras genom att de registreras av elektroniska sensorer.
De finns få begräningar för masspektrometri men vad är den största utmaningen ?
Att jonisera molekyler ifrån biologiska prover.
Biomolekyler gillar att vara i vatten, men masspetrofotometri gillar anlayter i gasform.
Några områden som använder masspektrometri?
- Analytisk kemi
- Läkemedelskemi
- livsmedelskemi
- forensisk kemi
Vad för vakuum område behövs för masspektrometri? Hur fås vakumet?
10^-4 till 10^-6
Vakuumet fås genom turbomolekylärpump.
Vad är förångning?
Ämne övergår från flytande form till gasform
Vad är jonisering?
Skapar joner av molekyler i gasfas.
Vad är masstal?
Vad är isotop?
Vad är en stabil isotop?
Vad är isobar?
Masstal: sammanlagda antalet protoner och neutroner i atomkärna
Isotop: Lika antal protoner men olika antal neutroner i kärnan
Stabil isotop: Ej radioaktiv
Isobar: ämnen har samma masstal men olika antal protoner i atomkärna
Vad är TIC?
De kromatogram man får ifrån en masspektrometer kallas för TIC. Det återfinns alltid ett värde som representerar den högsta signalen (inringat i blått).
En punkt i TIC motsvarar intensitet i spektrum, vilket betyder att TIC är uppbyggt av tusentals spektrum.
Spektrummet innehåller intensiteter för alla joner scannade under en specifik tid vanligen några millisekunder.
Intensiteten ökar när en analyt når masspektrometern.
Vad behövs för att bygga en masspektrometer?
1. Jonkälla= skapar joner av analyterna (gasfas, vätskefas,fastfas)
Joniseringstekniker
Elektronjonisering
En stråle av elektroner med hög energi bombarderar ångfasen och molekyljoner bildas. Överskottsenergi medför att molekyljoner fragmenteras.
Elektrospray
Med hjälp av elektriska fält bildas vätskedroppar, genom en förångning bildas de sedan joner
MALDI
?
2. Massanalysator
Kvadrupol
Består av 4 cylindriska stavar som ligger symmetrisk parallellt. Det är parvis kopplade till likström och växelström. Genom att ändra likström och växelström kan man få olika molekyler att nå detektorn.
Jonfälla
I denna metod fångas jonerna samtidigt in i en fälla skapad av ett elektriskt fält. Joner av olika mass-laddningsförhållande kan sedan skannas ut, liknande en kvadrupol.
Flygtid (TOF, time of flight)
Partiklarna accelereras i ett elektriskt fält så att de får samma rörelseenergi. Jonerna flyger sedan genom ett fältfritt område för att slutligen nå detektorn.
De lättaste jonerna kommer fram först Tidsskillnad mäts av detektorn och omvandlas till ett masspektrum.
Vart bildas elektrospray och vart dras joner som bildas in i masspektrometern?
Vilka komponenter är överstrukna?
varför kan de va bra att koppla ihop flera analysatorer?
- Man kan analysera fragment (Delar av joner)
- Ökar specifitet avsevärt
- Man har flera analys möjligheter
Beskriv grunden i kromatografi
- Analyten kan va i gasfas, flytande fas eller i lösning
- Analyten behöver befinna sig i mobilfas (mobilfas är vanligen en vätska eller gas). Analyten följer mobilfasens rörelse
- Baserat på analytens egenskaper så kan analyten intragera med stationär fas
Det hela är ett två-fas system = stationär fas och mobil fas
Kan du på något sätt kontrollera separationen som uppstår i kromatografen?
Ja genom att modifiera min mobilfas egenskaper
Vad är :
retentionstid
Selektivitetsfaktor
Teoretiska bottnar
Botten höjd
Retentionstid: Tid analyt befinner sig på stationär fas
Selektivitetsfaktor: skillnad mellan två analyter
Teoretiska bottnar: Kolonnens effektivitet
Botten höjd: jämför kolonners effektivitet
Vad är Van deemter-ekvationen?
Relaterar bottenhöjden för en analytisk kolonn till olika flödeshastigheter och kinetiska parametrar
Beskriv vätskekromatografins delar
Gelfiltering baserar sin separation på?
Molekylers storlek
Jonbyteskromatografi baserar separation på?
- Katjonbytare?*
- Anjonbytare?*
Separation baseras på : Laddning
Katjonbytare: binder positivt laddade molekyler
Anjonbytar: binder negativt laddade molekyler
Hur elueras proteiner ut kolonnen vid jonbyteskromatografi?
Elueras ur kolonnen med ökad jonstyrka, eller ökat pH
Vad är tunnskikts kromatografins uppbyggnad?
Stationär fas på platta och mobilfa i botten av en behållare.
vad visar bilderna
Kvadrupol
Består av 4 cylindriska stavar som ligger symmetrisk parallellt. Det är parvis kopplade till likström och växelström. Genom att ändra likström och växelström kan man få olika molekyler att nå detektorn.
Jonfälla
I denna metod fångas jonerna samtidigt in i en fälla skapad av ett elektriskt fält. Joner av olika mass-laddningsförhållande kan sedan skannas ut, liknande en kvadrupol.
Flygtid (TOF, time of flight)
Partiklarna accelereras i ett elektriskt fält så att de får samma rörelseenergi. Jonerna flyger sedan genom ett fältfritt område för att slutligen nå detektorn.
De lättaste jonerna kommer fram först Tidsskillnad mäts av detektorn och omvandlas till ett masspektrum.
