Elektrofores

Question 1

Vad är elektrofores?

Answer 1

Process där molekyler separeras baserat på storlek eller laddning.

Man använder ett elektriskt fält där molekyler så som DNA, RNA och proteiner kan vandra i en gel gjord av agros eller polyakrylamid

Det elekriska fältet består av en negativ laddning vid en ände som trycker molekylerna genom gelen och en positiv del som drar molekylerna genom gelen.

Question 2

Vilka frågor kan fraktionerade proteiner i plasma ge svar på?

Answer 2

• Inflammatorisk aktiviter
• Immunglobinfördelning
• Alfa-1 antitrypsinbrist
• Förekomst av M-komponent

Question 3

När använder du agros resp polyacrylamid?

Answer 3

Agaros: separation av nukleinsyror

Polyacrylamid: Separation av proteiner

Question 4

Vilka molekyler vandrar längst i gelen?

Answer 4

Små molekyler vandrar fortare än stora och därför också längre.

Question 5

Varför används buffert i elektrofores?

Exempel på buffert?

Answer 5

• Joner som ska bära strömmen
• Upprätthålla pH

Ex: TAE och TBE

Question 6

Vad består polyacrylamid av?

Answer 6

• Acrylamid
• Polyacrylamid
• Metylen-bis-akrylamid

Question 7

Vad avgör gelens porstorlek?

Answer 7

Förhållandet mellan akrylamid och metylen-bis-akrylamid

Question 8

Är akrylamid giftigt?

Answer 8

Ja i lösning men inte när gelen är färdiggjuten

Question 9

Hur är gelen uppbyggd?

Answer 9

Bis-akrylamid bildar tvärbryggor som förbinder polyakrylamid-kedjorna. De skapar ett nätverk som molekylerna måste ta sig igenom

Question 10

Vad är SDS-page?

Answer 10

Separerar proteiner efter storlek

Question 11

Vad är Isoelektrisk fokusering

Answer 11

Separerar proteiner efter skillnad isoelektrisk punkt

Question 12

vad är 2-dimensionell gel elektrofores?

Answer 12

Separerar proteiner först efter isoelektrisk punkt och sedan storlek

Question 13

Vad är western blot?

Answer 13

Separerar proteiner och detekterar med antikropp

Question 14

När man ska detektera proteiner på gel finns de några vanliga färgningar. Vilka är de?

Answer 14

• Coomassie blå
• Silverfärgning
• Fluorescenta färger
• Autoradiografi av radioaktivit inmärkta proteiner

Question 15

Vad är isoelektrisk punkt? Hur kan de uttnyttjas vid isoelektrisk fokusering?

Answer 15

Det pH där nettoladdningen hos ett protein är 0.

Proteiner kan inte röra sig i ett elektriskt fält när de nått sin isoelektriska punkt pga att de då är oladdade.

Detta uttnyttjas vid isoelektrisk fokusering

Question 16

Beskriv hur du kan göra för att proteinerna ska vandra till sin isoelektriska punkt

Answer 16

Jag tillsätter provet på en pH gradient, analyter kommer vandra till sin isoelektriska punkt. Alla proteiner har olik aisoelektrisk punkt vilket betyder att en separation är möjlig

Question 17

Hur fungerar IPG strips?

Answer 17

Buffrande grupper som binds kovalent till gel massan. Sura och basiska grupper blandas

Question 18

Hur kan vi få proteiner att separeras bra med avseende på storlek?

Answer 18

Prov värmebehandlas i närvaro av DTT för att proteinerna ska återfå sin primär struktur.

DTT: Bryter disulfidbryggor i protein

Värme: denaturerar proteiner

SDS-PAGE

SDS: binder in till proteiner med ett bestämt antal molekyler/aminosyra. Laddningen/massan blir konstant på proteinet. Oavsett hur stort proteinet är så kommer de nu att vandra lika fort i en lösning man lagt spänning över.

SDS gör proteinerna negativt laddade genom att lägga sig runt proteiner och maskerar då proteinets egna laddning. Alla protein får samma laddning relativt till sin storlek och då spelar ej aminosyrasammansättningen någon roll.

Storleksseparationen baseras på hur tätt nätverket av akrylamid är. Stora protein bromsas upp mer än små och vandrar därför långsammare

Question 19

Vad får du ut av en SDS-page?

Answer 19

• Proteinets storlek
• Proteinets renhet
• proteinets konc
• Identifiering av protein

Question 20

Hur fungerar 2D-page?

Answer 20

Isoelektrisk fokusering -> gelen läggs i en SDS-page->SDS page

Question 21

Vad använder man 2D elektrofores till?

Answer 21

• Separera tusentals proteiner på samma gång
• Bestämma proteinernas isoelektriska punkt
• Bestämma proteinernas molekylvikt
• Bestämma relativ mängd av varje protein (ex. före och efter behandling)
• Identifiera proteiner med masspektrometri
• Titta på protein modifieringar.