Elektrofores Flashcards
Vad är elektrofores?
Process där molekyler separeras baserat på storlek eller laddning.
Man använder ett elektriskt fält där molekyler så som DNA, RNA och proteiner kan vandra i en gel gjord av agros eller polyakrylamid
Det elekriska fältet består av en negativ laddning vid en ände som trycker molekylerna genom gelen och en positiv del som drar molekylerna genom gelen.
Vilka frågor kan fraktionerade proteiner i plasma ge svar på?
- Inflammatorisk aktiviter
- Immunglobinfördelning
- Alfa-1 antitrypsinbrist
- Förekomst av M-komponent
När använder du agros resp polyacrylamid?
Agaros: separation av nukleinsyror
Polyacrylamid: Separation av proteiner
Vilka molekyler vandrar längst i gelen?
Små molekyler vandrar fortare än stora och därför också längre.
Varför används buffert i elektrofores?
Exempel på buffert?
- Joner som ska bära strömmen
- Upprätthålla pH
Ex: TAE och TBE
Vad består polyacrylamid av?
- Acrylamid
- Polyacrylamid
- Metylen-bis-akrylamid
Vad avgör gelens porstorlek?
Förhållandet mellan akrylamid och metylen-bis-akrylamid
Är akrylamid giftigt?
Ja i lösning men inte när gelen är färdiggjuten
Hur är gelen uppbyggd?
Bis-akrylamid bildar tvärbryggor som förbinder polyakrylamid-kedjorna. De skapar ett nätverk som molekylerna måste ta sig igenom
Vad är SDS-page?
Separerar proteiner efter storlek
Vad är Isoelektrisk fokusering
Separerar proteiner efter skillnad isoelektrisk punkt
vad är 2-dimensionell gel elektrofores?
Separerar proteiner först efter isoelektrisk punkt och sedan storlek
Vad är western blot?
Separerar proteiner och detekterar med antikropp
När man ska detektera proteiner på gel finns de några vanliga färgningar. Vilka är de?
- Coomassie blå
- Silverfärgning
- Fluorescenta färger
- Autoradiografi av radioaktivit inmärkta proteiner
Vad är isoelektrisk punkt? Hur kan de uttnyttjas vid isoelektrisk fokusering?
Det pH där nettoladdningen hos ett protein är 0.
Proteiner kan inte röra sig i ett elektriskt fält när de nått sin isoelektriska punkt pga att de då är oladdade.
Detta uttnyttjas vid isoelektrisk fokusering
Beskriv hur du kan göra för att proteinerna ska vandra till sin isoelektriska punkt
Jag tillsätter provet på en pH gradient, analyter kommer vandra till sin isoelektriska punkt. Alla proteiner har olik aisoelektrisk punkt vilket betyder att en separation är möjlig
Hur fungerar IPG strips?
Buffrande grupper som binds kovalent till gel massan. Sura och basiska grupper blandas
Hur kan vi få proteiner att separeras bra med avseende på storlek?
Prov värmebehandlas i närvaro av DTT för att proteinerna ska återfå sin primär struktur.
DTT: Bryter disulfidbryggor i protein
Värme: denaturerar proteiner
SDS-PAGE
SDS: binder in till proteiner med ett bestämt antal molekyler/aminosyra. Laddningen/massan blir konstant på proteinet. Oavsett hur stort proteinet är så kommer de nu att vandra lika fort i en lösning man lagt spänning över.
SDS gör proteinerna negativt laddade genom att lägga sig runt proteiner och maskerar då proteinets egna laddning. Alla protein får samma laddning relativt till sin storlek och då spelar ej aminosyrasammansättningen någon roll.
Storleksseparationen baseras på hur tätt nätverket av akrylamid är. Stora protein bromsas upp mer än små och vandrar därför långsammare
Vad får du ut av en SDS-page?
- Proteinets storlek
- Proteinets renhet
- proteinets konc
- Identifiering av protein
Hur fungerar 2D-page?
Isoelektrisk fokusering -> gelen läggs i en SDS-page->SDS page
Vad använder man 2D elektrofores till?
- Separera tusentals proteiner på samma gång
- Bestämma proteinernas isoelektriska punkt
- Bestämma proteinernas molekylvikt
- Bestämma relativ mängd av varje protein (ex. före och efter behandling)
- Identifiera proteiner med masspektrometri
- Titta på protein modifieringar.
