HPLC laboration Flashcards
Berätta om bakgrunden till analysen av styren
Styren kan lätt tas upp via huden men huvudsakliga upptaget sker via lungorna. I kroppen metaboliseras styren genom oxidering till mandelsyra och fenylglyoxyl syra. Halterna av dessa i yrin används för att mäta styrenexponering.Analysen görs sedan med HPLC
Vad gör du för att underlätta uppskattningen av den totala exponeringen av styren ?
Jag tillsätter oxidationsmedel innan analys vilket omvandlar mandelsyran till fenylglyoxylsyra så att endast fenylglyoxylsyran motsvarar den styren som kroppen tagit upp.
Använder du dig av normal phase eller reversed phase vid HPLC?
Reveresed phase
Vad är reversed phase?
Stationär fas: opolär
Mobilfas: polär
Berätta om kolonnen i HPLC
Analyten pumpas in i kolonn packad med sfärer med affinitet för analyten i detta fall kiseloxid med opolär stationär fas. Stationär fasen består oftas av alkaner med 18 kol dvs c18 men även c8 och c4 är förekommande.
Stationär fasen har hög affinitet för hydrofoba komponenter i provet vilket gör att dessa stannar i kolonn längre än hydrofila komponenter.
Har vi mycket vatten i mobil fasen kommer komponenter adsorberas av stationär fas medan om vi har mycket organsikt lösningsmedel kommer de släppa.
Hur kan analytens interaktion med stationär fasen manipuleras?
Genom att öka eller minska andelen hydrofobt lösningsmedel i mobilfasen (vätska som pumpas genom kolonn).
Acetronil och metanol är vanliga lösningsmedel.
En mer hydrofob mobilfas gör att hydrofoba föreningar blir mindre benägna att interagera med stationär fasen.
Separationen i kolonnen kan ske på två olika sätt, vilka är sätten och vad är skillnaden på dem?
Isokratiskt
Konstant sammansättning av mobilfasen genom hela separationen
Gradient
Succesivt ändras mängden lösningsmedel i mobilfasen
Vilka toppar kommer du se i kromatogrammet och på vilken plats? Beskriv både för oxiderat prov och icke oxiderat
Icke oxiderat prov
Void kommer ses först, sedan hydrofila (mandelsyran) och sist hydrofoba (fenylglyoxylsyra)
Oxiderat prov
Void först och sedan hydrofob (fenylglyoxylsyra)
Beskriv ett väskekromatografi: i vilken ordning kommer komponenterna?
Vad är retentionstid Tr?
Tiden mellan provinjektion tills analyt toppen når detektorn
Vad är Tm/voiden?
Den tiden de tar för mobilfas att passera kolonnen
Vad beskriver Kapacitetsfaktorn/K/retentionsfaktorn?
Migrationskraften av en analyt i kolonn.
Vad innebär att kapacitetsfaktorn är mindre än 1?
Vad innebär att en kapacitetsfaktor är större än 20?
Vad är en ideal kapacitetsfaktor?
Vad innebär att kapacitetsfaktorn är mindre än 1?
Elueringen är så snabb att noggrann bestämning av dess retentionstid är svår att utföra
Vad innebär att en kapacitetsfaktor är större än 20?
Elueringen tar mycket lång tid
Vad är en ideal kapacitetsfaktor?
Ska ligga mellan 1-5
Vad beskriver selektivitetsfaktorn?
Hur bra separation mellan två analyter vi har på kolonnen med varsin kapacitetsfaktor.
Hur kan du förändra selektivitetsfaktorn på en kolonn?
- Ändra mobilfasens sammansättning
- Ändra kolonntemp
- Ändra sammansättning av typ/fabrikat/batch av stationär fas
Är smala eller tjocka toppar bäst? Varför är X bäst?
Smala. Smala toppar innebär att man kan separera flera komponenter per tidsenhet
Vad innebär teoretisk botten?
Smutsig kolonn
Analyten kan binda på få ställen -> breda toppar
Tvättad kolonn
Analyt kan binda överallt -> smal topp
Beräknas (se bild)
Ju högre värde på N desto bättre
Du ska bereda din mobilfas
(1000 ml): Natriumacetatbuffert pH 5,5 0,05 mol/L
Hur gör du?
Molvikt natriumacetat (fast kemikalie) : 136,08
Du ska bereda kalibratorer med olika kända koncentrationer genom att använda dig av stamkalibrator med på 10 mmol/L. Volym för varje kalibrator 400 µl.
Kalibratorer som skall beredas: 0,2,5,7 och 10 mmol/L
Hur gör du?
Varför används dk i analysen?
Den fångar in analytiska fel och visar på en metods precision och riktighet
Varför används kalibratorer i analys?
Har en känd koncentration vilket gör att dessa kan användas som referenser i analysen när vi ska bestämma okända provers koncentrationer
Vad sker när du tillsätter kaliumperganatlösningen till alla rör?
Mandelsyran oxideras till fenylglyoxylsyra
Vad sker när du tillsätter etanolen ?
Etanolen gör att oxideringen av mandelsyra till fenylglyoxylsyra stoppas.
Etanol-> acetaldehyd -> Ättiksyra
Hur kan du göra för att analystiden skall minskas?
Genom att förändra mobilfasens polaritet, genom att öka organiska lösningsmedelt
Hur bearbetar du dina resultat från kromatogram
- Retentionstiden ses i minuter
- Arean återses under retentionstiden
Beräkning av koncentration fenylglyoxylsyra
- Kalibreringskurva skapas med arean (y-axel) som en funktion av koncentrationen fenylglyoxylsyra i mM (x-axel)
- Ta arean för dina prov och avläs koncentrationen (för mer exakt beräkna värdet för y och beräkna x från y)
Beräkning av teoretiska bottnar
Se exempel på bild
Varför sker en cetrifugering?
För att få supernatant innehållande endast fenylglyoxylsyra
Bilden kan tänkas vara separation av två komponenter mhs reverded phase kromatografi.
Berätta om diagram A,B,C och D
A
A är det optimala fallet, då båda komponenterna ger smala toppar och är välseparerade från tm.
B
- B kan tänkas representera ett fall då kolonnen har åldrats, och åtgärden blir att försöka komma tillbaka till A.
- Andledningen till att kapacitetsfaktorn ökas kan vara att kolonnen har bundit andra komponenter som förhindrar interkationen med analyten.
- Vi kan pröva med att tvätta kolonnen I hög halt organisk modifierare tex acetonitril, och därefter köra provet igen. Om det inte funkar så bör en ny kolonn inköpas.
C
- I C fallet är det uppenbart att hydrofob interaktion med kolonn materialet är lågt och vi får toppar som kommer ut alldeles för nära voiden (dvs kapacitetsfaktorn är för liten).
- Öka interaktionen genom minskad mängd organisk modifierare i mobilfas bör göra att vi får ett kromatogram likande A.
d
- I D fallet är både kapacitetsfaktorn och selektivitetsfaktorn ogynsamma,
- åtgärder : tvätta kolonn och minska modifiera i mobilfas
Bilden kan tänkas vara separation av två komponenter mhs reverded phase kromatografi.
Beskriv de olika diagrammen A,B,C och D
A
A är det optimala fallet, då båda komponenterna ger smala toppar och är välseparerade från void och varandra.
B
I B har vi fortsatt bra separation, men komonenterna kommer ut för tidigt (låg kapacitetsfaktor). Minskad mänd organisk modifierare bör ge ökat kapacitetsfaktor för båda komponenterna och ge kromatogram liknande A.
C
I C, så kommer komponenteran ut väl separerade från void (bra kapacitetsfaktor värden) men vardera component separerar inte från varandra.
- Jag skulle först försöka att tvätta kolonnen
- därefter med att minska modifierare för att öka separationen mellan komponenterna (isokratisk) eller göra gradienten mindra brant (gradient körning).
- Ifall inget av detta funkar så får jag bytt till ny samma typ kolonn (ifall det funkat förut) eller använt en annan typ av kolonn (ifall man håller på att utveckla en ny hplc metod för nya komponenter.
D
D fallet är både kapacitetsfaktorn och teoretiska bottentalet ogynsamma, och att minska halten modifierare resulterar troligtvis att vi kommer till B. För att komma till A, så bör åtgärderna beskrivna under bade C och D tillsammans göra att vi återkommer till A.
Gå igenom labbens steg
:)
Vad gör du vid dessa fall:
- Låg kapacitetsfaktor (för snabb eluering)
- Hög kapacitetsfaktor (för långsam eluering)
- Dålig separation
Låg kapacitetsfaktor (för snabb eluering): minskar andelen organiskt lösningsmedel i mobil fas
Hög kapacitetsfaktor (för långsam eluering): Ökar andel organiskt lösningsmedel i mobilfas
Dålig separation: Tvätta kolonnen, minska modifierare, om inte något fungerar byt kolonn.
