Alkaliskt fosfatas laboration

Question 1

Enzymaktiviteten mäter vi genom att låta ALP reagera med pNPP. Hur fungerar den reaktionen?

Answer 1

ALP klyver bort en fosfat från pNPP. pNP är gul kan då mätas i spektrofotometriskt. Utifrån absorbansvärdet kan man räkna ut mängden mol pNP och med i förhållande till tiden för reaktionen även räkna ut enzymaktiviteten

Question 2

I laborationen bestämmer vi totalprotein genom att mäta absorbansen vid 280 nm. Hur fungerar det? Varför absorberar proteiner ljus vid 280 nm?

Answer 2

Aminosyrorna tyrosin, tryptofan och fenylalanin innehåller aromatisk ringstruktur som kan detekteras vid 280 nm

Question 3

Hur kan man eluera ut de proteiner som fastnar i jonbytarmassan?

Answer 3

ändra pH alternativt användning av en saltgradient eller en kombination av båda

Question 4

Vad är det som avgör om ett protein stannar i en jonbytarkolonn eller rinner igenom?

Answer 4

Hur väl den binder till stationär fasen, dvs har vi en anjonbytare kommer negativa joner fasta medan om vi har en katjonbytare kommer positiva joner fastna.

Genom att förändra pH eller saltgradient eller en komb av båda två kan man påverka elueringen

Question 5

Jonbyteskromatografi används för att preparera ALP, vilka alternativa metoder skulle man kunna tänka sig?

Answer 5

Affinitetskromatografi och Gelkromatografi

Question 6

Vilka egenskaper hos proteiner kan man använda för att separera dem? Vilka utnyttjas i alp laborationen?

Answer 6

Proteiner har olika laddning vid olika pH, genom att anväda sig av exempelvis en anjonbytare kommer den stationärafasen ha en hög affinitet för negativa proteiner. Eluering kan regleras genom att förändra mobilfasen sammansättning så att laddningen förändras.

Question 7

Hur kan man göra för att få ut proteiner i lösning från celler eller vävnader? Vilken metod används i den aktuella laborationen och vilken är principen för den?

Answer 7

Att få proteiner till lösning ser olika ut beroende på om vi har celler eller en hel vävnad. Cellerna kan bearbetas kemiskt medan preparering av en vävnad sker mekaniskt.

I denna laboration anväder vi oss av osmotiskt chock som går under lysering. Med lysering menas att cellen förstörs i detta fall de periplasmatiska rummet där alp återfinns.

Question 8

Vilken reaktion katalyserar ALP?

Answer 8

Hydrolys av fosfatasestrar