tema 9 Flashcards
¿por qué es complicada la purificación?
- debido a la complejidad de los organismos y al alto contenido de proteínas y otras sustancias que pueden contener en un tejido/organismo
- debido al hecho de que las enzimas pueden formar agregados con otras moléculas
¿qué hay que plantearse a la hora de extraer y purificar una enzima?
- elección del material de partida: extracto celular, tejido, órgano
- método de ruptura celular adecuado
- disponer de un ensayo enzimático adecuado
- técnica separativa:
- cromatográfica: filtración/intercambio iónico/afinidad
- solubilización/insolubilización: precipitación por salado/cambio de disolvente - eliminación del contaminante:
- filtración molecular
- diálisis - criterio de pureza: dependiendo del objetivo, tener una purificación mayor o menor
define purificación
aplicación de técnicas separativas hasta quedarnos con la enzima en la que estamos interesados, separándola de las demás debido a sus características físico-químicas distintivas
¿para qué hay que disponer de un ensayo enzimático apropiado en el proceso de purificación?
para emprender la purificación es necesario tener un ensayo enzimático que nos determine la actividad de la enzima; ya que esta actividad es proporcional a la concentración de la enzima
características de un ensayo enzimático para una purificación
- fácil de realizar, más importante que el hecho de que sea fiable o preciso
- que sea reproducible, que se realice siempre bajo las misma condiciones, que sea comparativo
- el sustrato debe de ser económico, estable y usarse bajo condiciones de saturación, para que la velocidad sea independiente de la [S] y proporcional a la [E]
¿cómo debe de ser la fuente de la enzima para la purificación?
la actividad enzimática/[E] varía en los distintos organismos y en los distintos tejidos de un mismo organismo
- elegir la fuente donde sea más abundante
- la fuente debe de ser lo más fresca posible
una buena elección de la fuente facilita mucho la extracción y la purificación
clasificación de las enzimas según su localización
- en solución verdadera: permanecen en solución dentro de la estructura celular cuando son eliminados los componentes particulados (citoplasma, medio extracelular)
- asociadas a estructuras celulares: en solución dentro de una estructura celular o asociadas al material lipoproteíco insoluble (mitocondrias, núcleo o peroxisoma)
técnicas para obtener un homogeneizado
- homogeneización mecánica: tejido animal/vegetal MUY blando
- homogeneización sónica: bacterias/levaduras/eritrocitos
- homogeneización térmica: bacterias/eritrocitos/cultivos celulares
homogeneización mecánica
- homogeneizador Potter-Elvehjem: cilindro con un embolo con las paredes esmeriladas; el simple rozamiento del tejido con las paredes produce si disolución
- homogeneizador de aspas: mediante fuerza mecánica se rompe los tejidos
- homgeneizador de paletas: se introduce la muestra en una bolsa y esta en una caja donde la bolsa es golpeada hasta su homogeneizado
homogeneización sónica
el choque de ondas sónicas/ultrasónicas produce un cambio de presión de miles de atmósferas
se hace uso de sonicadores
- homogeneizador tipo sonda: maquina que produce una onda y la transmite mediante una sonda
- homogeneizador baño sonizador: baño de laboratorio termostatizado cuyas paredes producen ondas
homogeneización térmica
se somete a la muestra a ciclos rápidos de congelación/descongelación. cuando el agua se congela pasa a ser cristales que dañan a las células
- ultracongeladores: congeladores que alcanzan los -80ºC
- nitrógeno líquido: alcanza hasta -195.8Cº
para las enzimas intracelulares, ¿qué hay que hacer antes de la rotura?
hay que resuspender a las células en un medio de extracción para asegurar la protección de la actividad enzimática
características del medio de extracción
- baja Tª
- soluciones tamponadas, con fuerza iónica adecuada
- adición de agentes protectores: inhibidores de proteasas, protectores de grupos funcionales
- componentes que faciliten la liberación de la enzima: detergentes
¿cómo conseguimos concentrar nuestra enzima a partir del homogeneizado?
mediante centrifugaciones diferenciales, a partir de las cuales obtenemos distintas fracciones
esquema de centrifugación diferencial + velocidades de centrifugación
600-900 xg/ 10-15 min
8 000-10 000 xg/ 20-30 min
105 000 xg/ 60 min
¿cuál es el requerimiento indispensable antes de proceder a la purificación?
que el extracto de enzima sea soluble
si tras la centrifugación diferencial se ha elegido el sobrenadante donde la enzima son solubles no hay que hacer nada; en cambio, si se elige la parte donde las enzimas son insolubles se procede a su solubilización mediante el uso de detergentes
esto es porque necesitamos que la enzima esté en una fase móvil para la purificación
técnicas de purificación
(a) cromatografía
- en capa fina
- en columna:
- de exclusión molecular/filtración de gel
- de intercambio iónico
- afinidad
(b) diálisis y ultrafiltración
define cromatografía
técnica separativa según las características físico-químicas diferenciales, es la técnica más usada
esquema cromatografía en capa fina
en desuso
esquema cromatografía en columna
tipos de cromatrografía en columna
según del material del que esté empapada la columna:
- de exclusión molecular/filtración de gel
- de intercambio iónico
- de afinidad
esquema cromatografía en columna de exclusión molecular/filtración de gel
esquema cromatografía en columna de intercambio iónico
esquema cromatografía en columna de afinidad
usada en los últimos estadíos de purificación
un ejemplo sería el uso de anticuerpos
diálisis características
- membrana de celofán
- pasiva
- difusión en equilibrio
- poro de 6-14 kD
- separación de moléculas x tamaño
- últimos pasos
ultrafiltración características
- membrana porosa polimérica
- activa
- difusión forzada por presión: las moléculas no difunden sino que pasan a la fuerza
- poros de 0,5-100 kD
- separación de moléculas x tamaño
- últimos pasos
criterios de homogeneidad
en cada paso de la purificación debemos hacer un ensayo enzimático para determinar el éxito de la purificación
se usa la AEE como criterio de purificación, debe aumentar a medida que avanzamos con la purificación
define rendimiento
cómo de eficaz ha sido la purificación
define grado de purificación
cuantas veces más pura tengo la enzima con respecto al primer paso de purificación, debe de aumentar
¿qué hacemos después de terminar una purificación?
se investiga la homogeneidad de la muestra mediante otros métodos analíticos:
- electroforesis
- cromatografía líquida
- focalización isoeléctrica
¿cómo sabemos que hemos terminado de purificar?
- si hemos alcanzado nuestro objetivo de purificación
- cuando la AEE no aumenta de un paso de purificación a otro
ver electroforesis y cromatografía líquida
