tema 4 Flashcards
características de un ensayo enzimático
- alta especificidad: para detectar solo la enzima en la que estamos interesados
- alta sensibilidad: para poder detectar la enzima en extractos donde haya baja concentración o este mezclada
- alta precisión
- metodología conveniente
tipos de ensayos enzimáticos
- continuo
- discontinuo
- directo
- indirecto
- estado estacionario
- estado preestacionario
define ensayo continuo
ensayo en el que se monitoriza la desparación del sustrato o la formación del producto
define ensayo discontinuo
ensayo en el que se producen distintas paradas a distintos tiempos de la reacción
y luego se determina la concentración de producto
se detiene la reacción mediante la introducción de sustancias desnaturalizantes, aumentando la temperatura, añadiendo secuestradores metálicos (metaloenzimas), con inhibidores, cambiando bruscamente el pH
¿cuál es la principal ventaja de los ensayos discontinuos?
debido a las paradas, se pueden usar técnicas más avanzadas (RMN, MS, radiactividad, cromatografía) que son útiles para la detección de actividad enzimática cuando hay baja concentración
¿cuál es la principal desventaja de los ensayos discontinuos?
más laboriosos, equipo mas sofisticado, personal especializado
define ensayo de estado estacionario
el estado estacionario es cuando se han formado todos los complejos ES
se detectan en los primeros minutos de la reacción
el método clásico es la determinación de la velocidad inicial
define ensayo de estado preestacionario
el estado preestacionario es cuando todavía no se han formado todos los complejos ES
se detecta en los primeros segundos de la reacción
se usan mecanismos automatizados y mecanizados
define ensayo directo
ensayo en el que se puede medir al concentración de sustrato o producto
define ensayo indirecto
ensayo en el que no se puede detectar la concentración de sustrato o producto y se requiere de una reacción acoplada para determinar la concentración de otra especie.
la enzima de la reacción acoplada debe de estar pura; la velocidad de esta debe de ser superior; la enzima debe de estar en exceso
lista de factores que afectan a un ensayo enzimático
- pH
- temperatura
- grado de oxidación de la enzima
- presencia de metales pesados
- presencia de proteasas
- polaridad del medio
efecto negativo y solución de la temperatura en un ensayo enzimático
efecto negativo: por encima o por debajo de la temperatura óptima, la enzima se desnaturaliza
solución: uso de dispositivos Peltier o de baños termostatizados
efecto negativo y solución del pH en un ensayo enzimático
efecto negativo: por encima o por debajo del pH óptimo, la enzima se desnaturaliza
solución: uso de sustancias tamponantes; la fuerza tamponadora depende de la concentración de la sustancia tampón; debe de tener un pKa adecuado (pKa es el logaritmo del valor de pH en el que este es estable)
efecto negativo y solución del grado de oxidación de la enzima en un ensayo enzimático
efecto negativo: precipitación y formación de agregados, debido a la presencia de -SH
solución: crear un ambiente reductor (ambiente con -SH): DTT, cisteína, glutatión reducido
efecto negativo y solución de la presencia de proteasas en un ensayo enzimático
efecto negativo: hidrólisis de la enzima
solución: inhibidores de proteasas (cóctel de inhibidores de distintas proteasas porque no sabes qué tipos de proteasas están presentes en el medio)
efecto negativo y solución de la polaridad del medio en un ensayo enzimático
efecto negativo: precipitación y formación de agregados (por la presencia de -SH)
solución: si el ambiente es hidrofóbico, añadir sustancias apolares (sacarosa, glicerol, DMSO, DFM); si el ambiente es hidrófilo, añadir sustancias polares (KCl, NaCl, NH4Cl)
efecto negativo y solución de sustancias interferentes en un ensayo enzimático
efecto negativo: en extractos crudos, a parte de nuestra enzima, encontramos otras sustancias, como S no deseados o otras E. Obtenemos sobreestimaciones o infraestimaciones
solución:
- ensayos en blanco
- diluyendo los extractos para que las interferencias no sean apreciables
- purificando
curva de avance de reacción
una curva de avance de reacción es una representación de la [ ] frente al tiempo
la concentración de producto y de sustrato son ambas proporcionales al tiempo en los primeros estadíos de la reacción, sirviendo para crear una curva de avanze de reacción cuya tangente se usa para calcular la velocidad
[S] y [P] son equivalentes, NO iguales
[ ] es proporcional al tiempo al principio, cuando la [ ] se va consumiendo ya no es proporcional
efecto de la [E]
la [E] es proporcional a la velocidades iniciales, tienen una dependencia lineal:
v = kcat · [E]
define constante catalítica
Kcat o número de recambio, es el número de reacciones que se producen en un centro activo por unidad de tiempo
efecto de la [S]
la [S] es proporcional a las velocidades iniciales hasta que se produce la saturación de la enzima, donde se alcanza la velocidad máxima
para calcular la Km y la Vmáx se usan métodos de linealización
a cuanto equivale 1 kat
1 kat = 1 mol de sustrato convertido en producto en 1 s
zimograma
- detección de proteasas en medio sólido
- gel de caseína + proteasas
- Electroforesis a 4Cº
- Incubación a 37ºC + tinción de caseína
Halo de aclaramiento: hay proteasas que han degradado a la caseína y por eso no está teñido
Así podemos comparar la actividad de distintas proteasas
actividad enzimática en placas
- detección de proteasas con actividad extracelular
- distintos cultivos bacterianos + caseína
las cepas positivas en proteasas mostrarán halos de aclaramiento
detección de actividad lipasa
la lipasa se encarga de descomponer el triglicerido en ácido graso + glicerol. La rodamina al interaccionar con ácido grasos forma un compuesto fluorescente que se puede observar
si el microorganismo tiene proteasas no se ve el compuesto fluorescente
