TEKNIK SILENCING GENE DENGAN RNA INTERFERENCE

Question 1

Kelemahan RNA antisense

Answer 1

Kurang spesifik
Efisiensi rendah
Sulit diprediksi

Question 2

Mekanisme RNAi

Answer 2

dsRNA - dsRNA processing (Dicer) - small interfering RNA (siRNA) 21-25 nt - RNA-induced silencing complex (RISC) - homologous mRNA target recognition - target cleavage

Question 3

Jenis-jenis RNA Kecil

Answer 3

1. Small Interfering RNA (siRNA)
   Berasal dari RNA untai ganda yang lebih panjang, siRNA dimasukkan ke dalam sel untuk memanipulasi ekspresi gen. SiRNA mengikat mRNA tertentu, yang menyebabkan degradasinya.
2. MikroRNA (miRNA)
   ditranskripsi di dalam nukleus dan diproses menjadi prekursor untai ganda. MiRNA dapat menargetkan beberapa mRNA, yang menyebabkan degradasi atau penghambatan translasi.

Question 4

RNA-Induced Silencing Complex (RISC)

Answer 4

RISC terbentuk ketika RNA kecil mengikat protein Argonaut. Kompleks ini penting untuk proses pembungkaman, karena memandu siRNA dan miRNA ke mRNA targetnya. Penargetannya tepat karena adanya pasangan basa antara RNA kecil dan mRNA target.

Question 5

Cara kerja siRNA

Answer 5

1. Pemrosesan oleh Dicer
2. Pemuatan ke Kompleks RISC (RNA-Induced Silencing Complex)
3. Pengenalan mRNA Target
4. Degradasi mRNA Target
5. Penghambatan Translasi (opsional)

Question 6

siRNA (small interfering RNA)

Answer 6

molekul RNA kecil berukuran sekitar 20–25 nukleotida yang berperan dalam proses RNA interference (RNAi) untuk mengatur ekspresi gen secara spesifik. Molekul siRNA biasanya bersifat double-stranded RNA (dsRNA) dengan ujung 2 basa nukleotida yang saling menggantung (overhang). siRNA mengarahkan degradasi mRNA target atau menghambat translasi mRNA sehingga menurunkan ekspresi protein yang dihasilkan.

Question 7

1. Pemrosesan oleh Dicer
2. Pemuatan ke Kompleks RISC (RNA-Induced Silencing Complex)
3. Pengenalan mRNA Target

Answer 7

1. dsRNA panjang dipotong oleh enzim Dicer menjadi siRNA pendek.
2. Salah satu untai siRNA (disebut guide strand) dimasukkan ke dalam kompleks RISC.
   Untai lainnya (passenger strand) biasanya didegradasi.
3. RISC dengan siRNA guide strand mengenali mRNA target berdasarkan urutan yang komplementer.

Question 8

4. Degradasi mRNA Target
5. Penghambatan Translasi (opsional)

Answer 8

4. Jika pencocokan basa antara siRNA dan mRNA sempurna, Argonaute dalam RISC memotong mRNA target di tengah wilayah komplementer.
   Potongan mRNA kemudian didegradasi lebih lanjut oleh exonuklease seluler.
5. Jika pencocokan tidak sempurna, siRNA dapat menghambat translasi mRNA tanpa memotongnya.

Question 9

Komponen yang berperan dalam RNAi

Answer 9

dsRNA
Dicer
AGO
RISC
siRNA
RdRP

Question 10

TEKNIK RNAi
Bahan

Answer 10

§ Biji padi Hawara Bunar dan IR64
§ Kloning kit vektor pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen™)
§ Vektor pANDA (koleksi Prof. Ko Shimamoto, NAIST, Japan)
§ Bakteri E. coli DH5α dan Agrobacterium tumefaciens AgL0

Question 11

Primer yang digunakan

Answer 11

3’UTR_B11-F (Amplifikasifragmen 3’UTR dan Cek orientasi insert)
3’UTR_B11-R
GUS – F (Cek GUS linker)
GUS – R
GUS_cek – F (Cekorientasi insert)
GUS_cek – R