Real-Time PCR

Question 1

PCR Real-Time merupakan teknik khusus yang memungkinkan reaksi PCR (1) PCR Real-Time memungkinkan kita (2)

Answer 1

1. divisualisasikan
   “dalam waktu nyata” saat reaksi
   berlangsung.
2. mengukur jumlah kecil
   rangkaian DNA dalam suatu sampel

Question 2

Contoh penerapan PCR real time

Answer 2

• Profil Ekspresi BRCA1 (gen terlibat dalam penekanan tumor, mengendalikan ekspresi gen lainnya)
• Pengobatan obat untuk infeksi HIV atau Covid bergantung pada pemantauan “viral load” > pengukuran langsung jumlah RNA virus pada pasien
• Persentase makanan GMO > mengukur jumlah DNA transgenik vs DNA tipe liar

Question 3

Sumbu x dan sumbu y pada grafik PCR

Answer 3

x: siklus
y: jumlah DNA

Question 4

Posisi gairs dengan nilai yang melambangkan nomor siklus where the trace crosses an arbitrary threshold yang disebut:
Nilainya berhubungan langsung dengan kuantitas awal DNA dengan Rumus:

Answer 4

Ct Value
2^Ct

Question 5

Seratus salinan gen 200-bp setara dengan

Answer 5

dua puluh attogram (2 x 10-17 g) dari DNA

Question 6

Bagaimana mengukur DNA?
Prinsip kerjanya?

Answer 6

menggunakan reagen yang berfluoresensi : Etidium bromida dan SYBR Hijau I

mengikat DNA untai ganda dan
memancarkan cahaya ketika disinari
dengan panjang gelombang tertentu.

Pewarna SYBR Green I berfluoresensi jauh
lebih terang daripada etidium.

Question 7

Instrumen PCR real-time terdiri dari TIGA komponen utama:

Answer 7

1. Thermal Cycler (mesin PCR)
2. Modul Optik (untuk mendeteksi fluoresensi dalam tabung selama proses)
3. Komputer (untuk menerjemahkan data fluoresensi menjadi hasil yang bermakna)

Question 8

Perangkat lunak waktu nyata mengonversi sinyal fluoresensi di setiap sumur menjadi
data yang bermakna.

Answer 8

1. Siapkan protokol PCR.
2. Mengatur tata letak pelat.
3. Kumpulkan data.
4. Menganalisis data.

Question 9

1. Nilai Ct kemudian dapat digunakan untuk
2. Data fluoresensi yang dikumpulkan selama PCR
3. Analisis lain untuk memberitahu prosuk apa yang ada di dalam suatu reaksi, dengan prinsip

Answer 9

1. menghitung jumlah DNA cetakan
2. Memberitahu seberapa banyak DNA
3. Kurva leleh
   Berdasarkan prinsip bahwa saat DNA meleleh (menjadi untai tunggal), pewarna interkalasi tidak akan lagi terikat dan berpendar.

Question 10

• Amplikon yang berbeda akan memiliki
• Primer-Dimer akan memiliki

Answer 10

• lelehan yang berbeda
• puncak leleh yang sangat berbeda.

Question 11

Crime Scene Investigator PCR Basics Kit
TYPICAL WORKFLOW

Answer 11

• Pengantar profil DNA
• Menyiapkan reaksi PCR
• Produk PCR elektroforesis
• Analisis dan interpretasi hasil

Question 12

Profiling DNA

Answer 12

penggunaan metode genetik molekuler untuk menentukan
genotipe yang tepat dari sampel DNA sehingga hasilnya pada dasarnya dapat membedakan satu manusia dari manusia lainnya.
Genotipe unik setiap sampel disebut profil DNA.

Question 13

Karena manusia 99,9% identik,
di mana penyelidik tempat kejadian perkara mencari perbedaan dalam profil DNA?
Daerah yang diperiksa adalah?

Answer 13

area genom yang unik dan bersifat “anonim” (tidak mengendalikan sifat atau fungsi yang diketahui)

Short Tandem Repeats or STR’s

Question 14

Lokus TH01 mengandung

Answer 14

pengulangan TCAT

Question 15

Agarose elektroforesis untuk memisahkan ukuran fragmen kecil

Answer 15

Gel 3%

Question 16

So how can we use
the Crime Scene Kit to
perform real-time
PCR???
Option 1
Option 2

Answer 16

Option 1
* Pengenalan profil DNA
* Menyiapkan reaksi PCR pada instrumen PCR waktu nyata, menggunakan reagen waktu nyata
* Produk PCR elektroforesis
* Analisis dan interpretasi hasil

Option 2
Protokol yang sepenuhnya baru.
Gunakan komponen kit untuk
demonstrasi PCR Real-Time
yang lengkap
* Gunakan protokol yang dimodifikasi:
– Encerkan DNA TKP yang disertakan dengan kit
100, 10000, 1000000 kali lipat.
– Jalankan reaksi dengan iQ SYBR Green Supermix pada
instrumen PCR waktu nyata.
- melihat kurva titik lelehnya