DNA Cloning Flashcards
Enzim yang digunakan untuk
1. Pemotongan DNA secara spesifik
2. Penyambungan DNA secara spesifik
- Restriksi endonuklease
- Ligase
Melastoma malabathricum
1. Toleran terhadap
2. Akumulator tinggi terhadap
3. Indikator
4. Asli
- asam + Al
- Al
- tanah asam
- hutan hujan tropis
Pembentukan kultur in vitro M. malabathricum, lebih baik dalam (1) daripada dalam medium (2) (tanpa hormon pertumbuhan)
- MS
- NN
Sintesis cDNA RT-PCR
1. cDNA MaMrp fragment
2. cDNA MaMfs fragment
3. cDNA MaMt2 fragment
- 640 bp
- 500 pb
- 300 pb
rRNA eukariot
28S
18S
5.8S
5S
rRNA Prokariot
23S
16S
5S
Elusi fragmen DNA
1. Gel yang mengandung fragmen DNA sasaran dipotong di atas
2. DNA diisolasi dari
- UV
- Gel agarosa
Construction of over-expression vector
pGWB5-MmCu/Zn-SOD-1
RB ~ NosP ~ NPT II ~ NosT ~ 35SP ~ MmCu/Zn-SOD-1 ~ GFP ~ NosT ~ 35S::HPT ~ LB
Kepanjangan dari
1. Nos
2. NPT
3. GFP
4. HPT
- Nospaline synthase
- Neomycin phosphotransferase
- Green Fluoresceine Proteine
- Higromycine phosphotransferase
35SP
Promoter kuat 35 S CaMV (Cauliflower mosaic virus)
Tidak ada di tanaman dimasukkan untuk transkripsi SOD lebih cepat tanpa tanaman harus stress dan membuat SOD jadi ditranskripsi terus menerus
Promotor 35SP
Vektro rekombinan diperbanyak di
E. coli DH5a
Heat shock transformation menggunakan lingkungan kaya kalsium yang disediakan oleh (1) untuk melawan tolakan elektrostatik antara (2).
- kalsium klorida
- DNA plasmid dan membran sel bakteri
Heat shock transformation
Peningkatan suhu yang tiba-tiba menciptakan pori-pori di (1) dan memungkinkan (2).
- membran plasma bakteri
- DNA plasmid memasuki sel bakteri
Competent cell
Prosedur
1. Inokulasikan kultur … ke dalam media LB dan inkubasi pada suhu … selama … dengan pengocokan kuat pada kecepatan …
2. Tuangkan … kultur yang tumbuh ke dalam … LB dalam labu berbentuk kerucut …. Panaskan kaldu hingga suhu …
3. Inkubasi pada suhu … dengan pengocokan pada kecepatan …
4. Pantau pertumbuhan secara teratur hingga … mencapai …
5. Setelah pertumbuhan yang sesuai tercapai, dinginkan kultur di atas …
- E. coli, 37C, 24 jam, 180 rpm
- 0,5 ml, 50 ml, 200 ml, 37C
- 37C, 180 rpm
- OD600, 0,35-0,4
- Es
Prosedur lanjutan
- Pindahkan kultur ke tabung sentrifus autoklaf dan kumpulkan pelet sel dengan sentrifugasi pada … selama … pada suhu …. Buang supernatan
- Suspensikan kembali pelet sel dalam … larutan … dingin. Inkubasi sel yang disuspensikan kembali di atas es selama …
- Kumpulkan pelet sel dengan sentrifugasi pada … selama … pada suhu …
- 6000 rpm, 5 menit, 4C
- 20 ml, CaCl2 50-mM, 20 menit
- 6000 rpm, 5 menit, 4C
Proses lanjutan
- Suspensikan kembali sel dengan … dingin. Jika diperlukan untuk menyimpan sel kompeten dalam jangka waktu lebih lama, suspensikan kembali sel dengan … dingin yang mengandung …
- Gunakan … sel kompeten yang telah disiapkan untuk transformasi
- Tuangkan sel kompeten ke dalam alikuot … dan simpan pada suhu … untuk penggunaan lebih lanjut
- 2,5 ml CaCl2 50-mM, 2,5 ml CaCl2 50-mM, 10% gliserol
- 100 mikroL
- 100 mikroL, -80C
Genetic transformation of E. coli
- Ambil E. coli yang kompeten dari freezer -80C
a. Gunakan sel … dalam banyak kasus
b. Jika ingin memotong di situs enzim Xbal atau DAM lainnya, gunakan sel … yang kekurangan metilase Dam dan Dcm - Nyalakan penangas air hingga …
- Masukkan sel yang kompeten ke dalam tabung … (Eppendorf atau yang serupa). Untuk mengubah konstruksi DNA, gunakan … sel yang kompeten. Untuk mengubah ligasi, gunakan … sel yang kompeten. Anda mungkin memerlukan lebih banyak atau lebih sedikit sel, tergantung seberapa kompetennya mereka
- Simpan tabung di atas …
- Tambahkan … DNA melingkar ke dalam sel E. coli. Inkubasi di atas es selama … untuk mencairkan sel yang kompeten
- a. DH5a
b. SCS110 - 42C
- 1,5 ml, 50 mikroL, 100 mikroL
- es
- 50 ng, 10 menit
Genetic transformation of E. coli (lanjutan)
- Masukkan tabung berisi DNA dan E. coli ke dalam air bersuhu … selama …
- Masukkan kembali tabung ke dalam es selama … untuk mengurangi kerusakan pada sel E. coli
- Tambahkan … (tanpa tambahan antibiotik). Inkubasi tabung selama … pada suhu …. (Tabung tidak dapat diinkubasi selama 30 menit, kecuali jika mencoba menumbuhkan DNA untuk ligasi yang lebih sensitif. Untuk ligasi, biarkan tabung selama 1 jam)
- Sebarkan sekitar … kultur yang dihasilkan pada pelat LB (dengan tambahan antibiotik yang sesuai - biasanya …) Tumbuhkan semalaman
- Pilih koloni sekitar … kemudian
- 42C, 45 detik
- 2 menit
- 1 ml LB, 1 jam, 37C
- 100 mikroL, Ampisilin atau Kanamisin
- 12-16 jam
Vektor berbasis T-DNA MiniTi untuk tanaman
Vektor yang dilucuti: tidak menghasilkan tumor; dapat digunakan untuk meregenerasi tanaman normal yang mengandung gen asing
- Vektor biner: gen … yang diperlukan untuk mobilisasi dan transfer ke tanaman berada pada … yang dimodifikasi
- Terdiri dari urutan …, penanda yang dapat dipilih (…), dan … untuk penyisipan gen asing
- vir, pTi
- RB dan LB, resistensi kanamisin, polilinker
