POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Question 1

Prinsip dasar PCR

Answer 1

Amplifikasi DNA > meniru proses replikasi DNA

Question 2

Teknik memperbanyak DNA selain dengan PCR

Answer 2

Kloning > DNA dimasukkan ke bakteri

Question 3

Beberapa yang perlu diperhatikan dalam menentukan amplifikasi spesifik target sequens

Answer 3

1. Memberi batas > primer kiri dan kanan
2. Primer harus komplemen dengan target dan tempat yang sesuai
3. Harus mengetahui sequens DNA yang ingin di PCR

Question 4

Penentuaan saat pembuatan primer dari arah

Answer 4

5’ ke 3’

Question 5

Kegunaan primer

Answer 5

-Sebagai pembatas
-Sebagai awalan untuk menginisiasi

Question 6

Macam primer

Answer 6

1. Forward primer standar (Primer F)
2. Reverse primer standar (Primer R)

Question 7

1. Komplemen dari reverse DNA
2. Komplemen dari forward DNA

Answer 7

1. Primer F
2. Primer R

Question 8

Komposisi PCR

Answer 8

DNA target
Primer
Nukleotida (dNTPs)
Taq polimerase
BUffer
MgCl2
PCR tube

Question 9

Dalam PCR air digunakan sebagai (1), yang digunakan merupakai untuk (2), penambahannya diakhir untuk (3)

Answer 9

1. Medium berlangsungnya reaksi kimia
2. Air murni untuk membersihkan logam
3. Mengecas volume

Question 10

Kegunaan buffer dalam PCR

Answer 10

menstabilisasi DNA polimerase sehingga bisa bekerja

Question 11

Syarat pada template DNA

Answer 11

Bebas dari inhibitor polimerase seperti logam berat
Tidak harus DNA murni
DNA bisa dari mana saja

Question 12

Primer yang digunakan dalam PCR harus (1), memiliki ketahanan suhu untuk (2), memiliki panjang sekitar (3)

Answer 12

1. Spesifik
2. Annealing sekitar 57-65C
3. 15-30 semakin panjang semakin bagus (spesifik)

Question 13

Nukleotida yang digunakan dalam PCR

Answer 13

aktif NTPs
dATP, dGTP, dTTA, dCTP

Question 14

Magnesium berfungsi sebagai (1) konsentrasi yang digunakan harus pas karena jika terlalu sedikit akan (2) jika terlalu banyak akan (3)

Answer 14

1. Kofaktor DNA polimerase
2. Tidak bisa bekerja
3. DNA terlalu rekat sehingga sulit terlepas atau hasil elektro akan smir

Question 15

Taq polimerase berfungsi sebagai (1) berasal dari (2)

Answer 15

1. Ekstensi, memasang-masang
2. Bakteri termos aquatikus

Question 16

PIMER DESIGN GUIDLINES

Answer 16

1. Primer sequence
2. Primer length
3. GC content %
4. GC clamp
5. Melting temperature (Tm)
6. Annealing Temperature (Ta)

Question 17

1. Urutan primer:

• Harus komplementer dengan …
• Hindari:

Answer 17

• urutan pengapit dari wilayah target
• Urutan komplementer antara primer.
• Pengulangan (mis.: ATATATAT) à misprime.
• Pengulangan (mis.: AGCGGGGGAT) à misprime.
• Ketidakcocokan pada ujung 3’.
• Homologi silang.

Question 18

2. Primer length
3. GC content
4. GC clamp

Answer 18

2. panjang primer yang optimal adalah 18-25 bp. Tidak terlalu panjang atau terlalu pendek
3. 40-60%
4. Kehadiran basa G atau C dalam lima basa terakhir dari ujung 3’ primer. * Tidak lebih dari 2 G atau C

Question 19

5. Melting temperature (Tm)
   * What is Tm?
   * Perbedaan maksimum diantara primer pairs
   * Rumus

Answer 19

• Suhu leleh pada kisaran 50-60 °C umumnya menghasilkan hasil terbaik.
• 5°C.
• Tm = [(G + C) x 4] + [(A + T) x 2]