Microsatellites Flashcards
Apa itu microsatellite
Poly A/T most common 1-10 bp tandemly repeated
Tipe microsatellite
-Di, tera, tri nucleotide
- Perfect
- imperfect
- Compound
Microsatellite sebagai
Penanda DNA yang kuat untuk mengukur variasi genetik dalam dan antar populasi suatu spesies
Short Tandem Repeats (STRs)
1. Homozygot
2. Heterozygot
- Kedua alel memiliki panjang yang sama
- Alel berbeda dan dapat dipisahkan satu sama lain
- Microsatellite types based on repeat pattern
- Based on number of base pair
- The different between minisatellites
1.
Perfect -CACACA-
Imperfect -CACACA-CACACA-CACACA
Compound -CACACACATCATCAT-
Complex -CACACA-AATAATAAT
2.
Mono (CCCCC)
Di (TA TA TA)
Tri (CCA CCA CCA)
Tetra (GATA GATA GATA
- 9-65 pasangan basa diulang dari 2 hingga beberapa ratus kali
Microsatellites properties
- Co-dominant
- Pewarisan dengan mandel
- Lokus polimorfik dengan jumlah alel setinggi 14-15 per lokus
Mikrosatelit dan Penyakit Manusia
Variasi ukuran alel pada lokus mikrosatelit yang berdekatan (1)
Contoh penyakit yang bisa dideteksi (2)
telah dilaporkan menyebabkan kelainan genetik; oleh karena itu kelainan genetik ini dapat dideteksi dengan (3)
- (menunjukkan ketidakseimbangan hubungan) dengan gen-gen berikut dalam wilayah Kompleks Histokompatibilitas Utama (MHC) Manusia
- IDDM (Diabetes Melitus yang Bergantung pada Insulin)
Sklerosis Ganda (MS)
Narkolepsi
Uveitis - menyaring ukuran alel lokus mikrosatelit (penanda Tipe I) yang berada di dekat gen tersebut
Masalah
-Informasi awal genom sangat penting karena primer sangat spesifik
-Stutter Band
-Ukuran sampel yang tinggi
-Mutasi pada situs pengikatan primer dan wilayah benzem primer serta pengulangannya dapat menimbulkan alel dan genotipe yang salah.
-Homoplasi
Guidelines for PCR primer design
Cukup rumit sehingga tidak ada kemungkinan menemukan urutan selain target
Kemungkinan urutan 16 basa dalam genom adalah 4^16 (Sekali dalam 4 miliar)
Panjang minimal: 17
Kisaran panjang ideal: 17-30 nukleotida
Primer orientasi
Jika sekuens primer maju dan mundur dirancang dari data sekuens untai pengkode DNA (tetapi tidak untuk mikrosatelit), maka perlu diingat bahwa primer mundur harus cocok dengan sekuens untai non-pengkode
Base composition
Pasangan GC memiliki 3 ikatan hidrogen - Pasangan yang lebih kuat - Membutuhkan lebih banyak panas daripada pasangan A=T untuk pemisahan
Kandungan GC ideal : 35-60%
Perbedaan kandungan GC dari 2 primer tidak lebih dari 5%
Kandungan GC yang lebih tinggi menyebabkan denaturasi yang buruk bahkan pada suhu 95°C
- Melting temperature (Tm values)
- Annealining temperature
- Kedua primer harus memiliki Tm values yang mirip
Perbedaan minimal 1-4 C
Tm ada di range 40-60 C - 5C dibawah Tm
Yang harus diihindari dalam Spesifikasi tentang komplementaritas antara urutan pasangan primer
Hindari komplementaritas antara pasangan primer
Hindari komplementaritas dua atau tiga basa pada ujung 3’ pasangan primer untuk mengurangi pembentukan primer-dimer
Hindari ketidakcocokan antara ujung 3’ primer dan urutan target-templat.
Hindari rangkaian pelengkap dalam suatu primer.
Hindari lintasan 3 atau lebih G & C pada ujung 3’.
Hindari T ujung 3’. (Primer dengan T pada ujung 3’ memiliki toleransi lebih besar terhadap ketidakcocokan).
Spesifikasi tentang komplementaritas antara urutan pasangan primer yang perlu diperhatikan
Memiliki ujung 3’ yang kaya GC (“penjepit GC”): GC memiliki 3 ikatan hidrogen dan mengikat lebih kuat daripada A dan T. Beberapa G atau C pada ujung 3’ (ujung pemanjangan) primer akan membuat ujung tersebut lebih stabil dan dapat meningkatkan hasil PCR.
Ambiguity/degenarate codes
Forward strand
Y=C/T
R=A/G
H=A/C/T
N=A/C/G/T
W=A/T
Reverse strand
R=C/T
W=A/T
