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MMD1042 > Technologie de l'ADN > Flashcards

Technologie de l'ADN Flashcards

1
Q

Qu’est-ce qu’une nucléase et quels sont les 2 types (décris les)

A

Nucléase: enzyme qui clive les liens phosphodiester de brins d’acides nucléiques en deux nucléotides

Exonucléases: enzyme qui coupes les acides nucléiques à partir des extrémités de l’ADN ou de l’ARN, un nucléotide à la fois
- de 5’ vers 3’
- de 3’ vers 5’

Endonucléases: enzyme qui coupe les acides nucléiques au milieux de la chaine d’acides nucléiques pour produire des fragments

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Q

Donne un synonyme d’enzyme de restriction et explique c’est quoi

A

Endonucléases de restriction

Coupe l’ADN bicatenaire à des endroits caractérisés par des séquences nuclétotidiques spécifiques: sites de restriction

Reconnaissent et coupent l’ADN à des endroits/séquences spécifiques

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3
Q

Pourquoi les bactéries ont elles des enzymes de restrictions

A

Pour assurer le défense (système de de défense) contre les virus de bactéries (bactériophages) qui pourrait s’insérer dans leur ADN: permet de couper la séquence d’ADN étranger en morceaux pour la rendre inactive

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4
Q

Que reconnaissent en majorité les enzymes de restriction

A

Reconnaissent les séquences palindromiques

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5
Q

Qu’est-qu’un palindrome/séquence palindromiques

A

Séquence d’ADN qui se lit de la même facon dans les deux sens
- lecture 5’ 3’ est la même pour les 2 brins

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6
Q

Quels sont les deux types de bouts d’ADN donnés par les enzymes de restriction et donne des exemples d’enzymes

A

Bouts collants: clivage du lien phosphodiester après le premier nucléotide partant de l’extrémité 5’ de chaque brin
- EcoRI
- HindIII

Bouts francs: clivage du lien phosphodiester au même endroit sur les deux brins
- EcoRV
- HaeIII

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7
Q

Qu’est-ce qu’un cartographié de restriction

A

Probabilités de séquences coupées par chaque enzyme de restriction sur de l’ADN isolé; différents sites de clivage selon les différentes enzymes sur l’ADN

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8
Q

Quel a été le premier outil en biologie moléculaire pour caractérisé l’ADN en général

A

Enzymes de restriction

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9
Q

Comment se fait la séparation et l’identification des fragments d’ADN coupés après digestion des enzymes de restriction

A

Électrophorèse sur gel pour séparer les fragments d’ADN selon leur taille

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10
Q

Quel est le principe de l’électrophorèse sur gel

A

Faire migrer les fragments d’ADN sur un gel d’agarose dans un champ électrique
- ADN chargé négativement va migrer vers l’anode (+) du champ électrique
- gel d’agarose ralenti la progression dans la champ selon la taille des fragments (plus petit = migre plus vite, donc loin)
- permet d’identifier les fragments d’ADN selon leur taille

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11
Q

Comment est-il possible d’observer les fragments d’ADN sur le gel

A

Détection se fait par
1. insertion du bromure d’éthidium (agent intercalant dans la double hélice) et exposition à la lumière UV;
- donne une fluorescence aux fragments d’ADN exposés à la lumière

  1. ADN marqué radioactivement
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12
Q

Comment pouvons nous obtenir une cartographie de l’ADN

A
  1. Insérer une enzyme de restriction avec ADN
  2. Procéder à l’électrophorèse sur gel pour fair migrer les fragments et estimer les sites de restriction selon la taille des fragments d’ADN
  3. Faire la cartographie avec les différentes enzymes essayées
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13
Q

Quelle enzyme permet de joindre les fragments d’ADN coupés par les enzymes de restriction et quel est ce processus

A

Enzyme: ligase
Processus: ligation

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14
Q

Quels sont les 2 types de ligation et laquelle est plus forte et pourquoi

A

Ligations d’extrémités cohésives (bout collants)
- plus forte parce que l’appariement se fait entre les bases (affinité), ce qui stabilisent les interactions et la formation du lien phosphodiester
- les bouts liés doivent avoir été digéré par les mêmes enzymes de restriction (ex: EcorRI) = reforme le palindrome

Ligation d’extrémités franches (bouts francs)
- 100 fois plus faibles parce que les contacts entre les deux fragments dépendent de collision aléatoires pour former les liens phosphodiesters

*les deux utilisent la ligase et l’ATP

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15
Q

Que permet la ligation

A

Recombinaison de l’ADN en laboratoire en joignant deux ou plus fragments d’ADN coupés par les enzymes de restriction grâce à la ligase

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16
Q

Comment Paul Berg a t il permis de perpétuer et de produire l’ADN recombinant en quantité limité

A

À eu l’idée d’insérer un vecteur qui peut se répliquer de facon autonome

La ligation du fragment d’ADN dans le vecteur est dit: clonage

Le vecteur utilisé est un plasmide

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17
Q

Quel est le vecteur utilisé dans l’ADN recombinant

A

Plasmide

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18
Q

Qu’est-ce que le clonage/cloning

A

Insertion d’un fragment d’ADN dans un vecteur (plasmide) qui peut se répliquer de facon autonome

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19
Q

Qu’est-ce qu’un plasmide et peut-il se répliquer

A

Un cercle d’ADN bicaténaire qui peut se répliquer de facon autonome

Le plasmide contient les origines de réplication fonctionnel et les gènes spécifiques qui codent pour des protéines nécessaires à sa réplication dans l’hôte

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20
Q

Qu’est-ce qu’un vecteur

A

Palmide qui a été manipulé en laboratoire dans lequel on peut insérer des fragments d’ADN

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21
Q

Quelles sont les séquences d’ADN qu’on peut retrouver dans un plasmide d’une bactérie

A
  1. Séquence de réplication de la bactérie (origine de réplication)
  2. Gène de sélection (résistance à l’antibiotique) pour sélectionner/identifier spécifiquement les bactéries qui contiennent le vecteur et le gène cible inséré
    - bactéries en vie = possèdent le vecteur
  3. Sites de restriction dans lesquels on peut insérer des fragments
  4. Sites de mutliclonage avec plusieurs site de clonage en ligne pour faciliter le clonage de fragments d’ADN
    - permet d’insérer plusieurs fois le fragments et donc de produire plusieurs fois la même protéine
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22
Q

Qu’est-ce que la transformation des bactéries et comment peut-on identifier que ce processus a été fait

A

Transformation: procédé d’introduction d’un plasmide dans une bactérie

Pour déterminer si la bactérie a intégré le plasmide, le plasmide contient un gène de sélection/marqueur de sélection comme la résistance aux antibiotiques (ex: ampicilline)
- si la bactérie survie et forme des colonies dans l’antibiotiques, elle contient le plasmide, donc se sont des cellules clonées
- si non, elles meurent car pas de gène de résistance à l’antibiotique, donc pas de plasmide

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23
Q

Quelle est l’efficacité de la transformation (introduction d’un plasmide)

A

1/2000 bactéries

24
Q

Qu’est-ce que l’amplification de l’ADN

A

Tranformation d’un bactérie par introduction d’un plasmide avec un nouveau fragment d’ADN

Multiplication des bactéries qui ont le plasmide et donc le gène d’intérêt intégré dans le plasmide

25
Q

Quelles sont les utilisation possibles de l’ADN amplifié (3)

A
  1. permet de préparer une grande quantité de l’insert (fragments d’ADN inséré dans le plasmide) par la multiplication des bactérie
    - séquencé l’ADN inséré
  2. Permet de poursuivre un autre clonage avec ce plasmide; perpétuer le plasmide
  3. Permet la production de protéines recombinantes en grande quantité (insuline, hormone GH, facteurs de coagulation, immunogène vaccin, lactose (lactaide)
26
Q

Comment se fait la production de protéines recombinantes et quel est son intérêt

A

Recombinaison de l’ADN (insertion d’un fragment d’ADN qui code pour une protéine dans un plasmide) pour permettre à une bactérie d’intégrer le plasmide/vecteur et de produire une protéine d’intérêt médical (insuline) ou biotechnologique (enzyme qui digèrent la lignine du bois)

27
Q

Décris les étapes de la production de protéine recombinantes thérapeutiques

A
  1. Vecteur avec promoteur bactérien qui permet l’initiation de la transcription
  2. Clonage du gène
    - Enzyme de restriction coupe le vecteur au site de restriction près du promoteur
    - Ligation du fragment d’ADN
  3. Transformation: introduction du plasmide dans la bactérie
  4. Surexpression et purification de la protéine (insuline, hormone GH, etc.) produite en grande quantité par les bactéries qui ont intégrées le plasmide
28
Q

Qu’est-ce que la GFP (green fluorescent protein) et son intérêt

A

Protéine fluorescente de la méduses

permet de fusionner le gènes avec les gènes d’intérêt à étudier pour observer :
- les niveaux de trasncription d’un gène
- les niveaux de traduction
- la localisation cellulaires de protéine
- la co-localisation cellulaire de protéines

29
Q

Comment pouvons nous observer la co-localisation de protéines

A

Grâce à des protéines fluorescentes de différentes couleurs

30
Q

Quelles sont les propriétés de l’ADN polymérases et ses particularités in vitro et in vivo

A
  1. Polymérisation de l’ADN toujours de 5’ vers 3’
  2. Besoin d’une amorce pour ajouter des nucléotides à l’extrémité 3’OH déjà existant
    - in vivo: ajout d’une amorce sur le brin conducteur et de plusieurs amorces sur le brin tardif fragments d’ogasaki
    - in vitro: amorce = oligonucléotide d’ADN ou d’ARN, 3’ du brin d’ADN en polymérisation
  3. Besoin d’une matrice simple brin
    - in vivo: séparation des brins d’ADN/ouverture de la double hélice par hélicase
    - in vitro: séparation des brins de l’ADN par dénaturation thermique
31
Q

Comment se fait la dénaturation de l’ADN

A

Doubles brins d’ADN se séparent en simples brins par l’augmentation de la température (même chose avec augmentation du pH)

32
Q

Dans les courbes de dénaturation de l’ADN, pourquoi les régions poly A-T se dénaturent plus rapidement que les régions poly G-C

A

Les bases A-T sont liées par deux liens hydrogènes alors que G-C est formé de 3 liens hydrogènes, ce quo nécessitent une température plus élevé (plus d’énergie) pour briser la charge électrostatique/lien H)

33
Q

Qu’est-ce que le principe d’hybridation

A

C’est le fait que les deux simples brins d’ADN dénaturé peuvent de ré-hybrider/recombiner (renaturer) pour reformer la molécule double brin d’ADN en abaissant la température (devant aux bonnes conditions initiales)

C’est le rappariement des brins par un retour aux conditions initiales

34
Q

Comment peut on déterminer la séquence d’un fragment d’ADN et à quoi sert-elle

A

Par la méthode de terminaison de chaine (appelée didéoxy) ou méthode de Sanger

Peut détecter la présence de mutation dans une gène

(permet de déterminer la taille des différents fragments possibles pour ensuite les comparer à des fragments d’intérêts)???

35
Q

Quel est le principe général de la méthode de Sanger

A

Permet d’ajouter de facon aléatoire des didéoxyribonucléotides qui s’insèrent dans la polymérisation de l’ADN et qui vont arrêter la réplication de l’ADN lorsqu’ils sont liés

Permet de déterminer la séquence d’un fragment d’ADN

36
Q

Quelles sont les étapes de la méthode de Sanger (in vitro)

A
  1. Séparation des brins (dénaturation thermique) et ajout de l’amorce (oligonucléotide)
  2. Ajout: des amorces; des désoxyribonucléotides (dG, dA, dT, dC) dont un des dNTP est marqué pour détection
  3. Ajout des didéoxyribonucléotides (ddNTP) par tube
    et ajout de l’ADN polymérisase pour polymérisation
  4. Séparation sur gel et détection des brins synthétisé par extension de l’amorce
  5. Lecture de la séquence sur gel: permet de déterminer où le didéoxynucléotides s’est inséré
    - moins de migration = moins de réplication = ddNTP arrivent plus tôt
37
Q

Pourquoi les didéoxyribonucléotides arrêtent t il la synthèse protéique

A

Parce qu’il ne possèdent pas de groupement OH à leur extrémité 3’, donc l’ADN polymérase ne peut pas ajouter d’autres nucléotides, car elle a besoin du OH à l’extrémité 3’

38
Q

Comment pouvons nous produit beaucoup d’ADN à partir de quelques molécules

A

Par le PCR: Polymerase chain reaction

  • permet entre autre de détecter le virus Corona ces les patients
39
Q

Explique le principe du PCR

A

Procède à la réplication de l’ADN cycle en mettant une quantité importante d’amorce pour initier rapidement la réplication

  1. Dénaturation de l’ADN pour séparer les brins (95 degrés)
  2. Hybridation/fixation de l’amorce (55 degrés)
  3. Polymérisation par la Taql polymérase qui agit à température élevée (permet de garder les brins d’ADN séparés en même temps que l’amorce d’oligonucléotide restent fixée) (72 degrés)
    - ADN polymérase de E.coli fonctionnelle à 37 degrés
40
Q

Quelle est la vitesse de l’amplification par le PCR

A

20-30 cycles de réplication d’environ 5 minutes chacun

41
Q

Quelle est la longueur moyenne d’une amorce pour le PCR (oligonucélotides) et quelle est l’importance de la longueur

A

15-30 nucléotides

Plus l’amorce est longues, plus est elle spécifique, reconnait moins le région dans le génome

42
Q

D’où provient la taq polymérase et quelle est son utilité

A

Provient d’une bactérie thermophile: permet à la polymérisation de se faire à température élevée, donc maintenant les brins d’ADN séparés et l’amorce fixé pour accéléré la réplication

43
Q

Quelles sont les séquences inutiles/intergéniques répétées

A

Séquences répétées en tandem dans un même locus
- STR: short tandem repeat (2-6 nucleotides)
- VNTR: variable number of tandem repeats (10-100 nucleotides)

44
Q

Combien de fois peuvent être répétées les STR et les VNTR et comment varient t ils entre les individus

A

STR: répétés 5 à 200 dans un même locus
VNTR: répétés 10-1500 fois dans un même locus

Le nombre de répétition varie entre les individus ce qui permet de les distinguer

45
Q

Comment les STR et les VNTR peuvent-ils être utilisés pour le DNA fingerprinting en médecine légale

A

Comme le nombre de répétition varient d’un individu à l’autre le pcr permet d’amplifier l’ADN d’un petit échantillons (taches de sang, cheveux, tissu de la peau) et de reconnaitre la longueur des différentes séquences répétées sur gel pour identifier les individus

Plus la séquence testé est polymorphisme, plus le test est efficace

46
Q

Qu’est-ce qu’un polymorphisme

A

Variation dans le nombre de répétition des STR et des VNTR entre les individus

47
Q

Qu’est-ce qu’un SNP (snip)

A

Type de polymorphisme: variation/polymorphisme d’un seul nucléotides (single nucleotide polymorphisme)

48
Q

Quel est le % de variations génétiques humaines provoquées par les SNP (snips)

A

90%

49
Q

Comment nomme t on les sites de séquences d’ADN où un seul nucléotides varient entre les individus

A

SNP: polymorphismes de nucléotides simples

50
Q

La séquence d’ADN de deux individus choisis au hasard est identique à quel %

A

99,9% identique
0,1% caractérisent les variations génétiques entre les individus

51
Q

Quelle est la contribution des SNP

A

Contribuent aux variations génétiques humaines

52
Q

Quelle est la différence entre les SNP et les mutations

A

SNP: variation de base de l’ADN dans plus de 1% de la population (variante dans la population et non un cas unique)

Mutation: variation de base dans l’ADN dans moins de 1% de la population

53
Q

Quels sont les différents traits génétiques associés aux SNP

A
  • couleurs de yeux et des cheveux, grandeur
  • performance musculaire
  • comportement social
  • hérédité et susceptibilité à des maladies (diabète, obésité, maladie cardiaque, cancer, fibrose kystique, etc.)
  • réponse individuelle aux médicaments (toxicité, hypersensibilité, résistance)
54
Q

Donne des exemples de variation génétiques associées aux SNP

A
  1. Variation génétique dans le gène BRCA-1 augmentent 7x les chances d’avoir le cancer du sein chez la femme
  2. Manque de 3 nucléotides à un site spécifique = fibrose kystique si on est homozygote (mutation?)
55
Q

Quel est le but du projet HapMap

A

Identifier les susceptibilité génétique à des maladies
- Identifier les différences génétiques de la population pour permettre de prédire la susceptibilité à des malaides
- développer des tests génétiques pour prédiquer si un individu va développer ou non une maladie particulière
- offrir un traitement personnalisé pour prévenir ou délayer le commcement d’une maladie; développer une médecine personnalisée à la génétique d’un individu

56
Q

Quelle est la différence entre la médecine traditionnelle et la médecine personnalisée

A

Médecine traditionnelle
- educated guess sur le meilleur traitement à prescrire (inclut pas les personnes qui réagissent pas ou mal au traitement)

Médecine personnalisée
- utilisation d’analyses moléculaires pour aider les médecins à choisir un traitement pour le patient atteint d’une plus efficace selon sont profil génétique et environnemental

57
Q

Quelle est le but de CRISPR-Cas 9

A

Permet de modifier le génome de facon spécifique
- introduire un ARN de reconnaissance d’ADN de phage dans un complexe de nucléase (Cas-9) pour cliver l’ADN double brin du phage lorsque présent

MMD1042 (31 decks)

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