Techniques Biochimiques FINAL Flashcards
Dosage protéique, WB et ELISA
4 méthodes sont couramment utilisées pour la dosage protéique
– Absorption UV de chaînes latérales (280 nm)
– Réactions chromogéniques sous conditions alcalines (test Biuret) ou (BCA)
– Liaison d’un chromophore à la protéine (test Bradford) ou (Coomassie)
– Dot-blotting (immobilisation protéine sur membrane suivie d’une coloration de la membrane)
Quelles sont les substances interférentes pour le dosage à l’absorbance UV?
- Acides nucléiques
- Acides,
- Détergents
- Sels
Quelles sont les substances interférentes pour le dosage BCA?
- Agents réducteurs
- Agents chéalteurs
- Lipides
Quelles sont les substances interférentes pour le dosage Coomassie?
Détergents
Quelles sont les substances interférentes pour le dosage Dot-blot?
Aucune substance interférente.
dans quelle milieu est-ce que le test de bradford se passe?
-Acide
-Alcalin
Acide
Quelle colorant va se lier aux protéines lors de la teste bradford?
Un colorant Coomassie
Quelle couleur se produit lors de la liaison d’une colorant coomassie à une protéine lors de la teste Bradford?
une coloration bleue (595 nm)
Quelles résidus de la protéine est-ce que le colorant coomassie va se lier lors de la teste Bradford?
Les résidus basiques (Arg) et aromatiques.
Quelles sont les deux standards qu’on utilise usually lors d’une test Bradford?
Quelle sont leur gamme de concentration?
BSA (125 - 1000ug/mL)
ou
IgG (125 - 1500ug/mL)
Définit : Protéine totale (mg)
quantité de protéine présente dans la fraction
(obtenue en déterminant la concentration de protéine dans chaque fraction et en multipliant par le volume total des fractions)
Définit : Activité totale
activité enzymatique pour chaque fraction
(obtenue en mesurant l’activité enzymatique dans le volume de fraction utilisé puis multiplié par le volume total des fractions)
Activité spécifique :
activité totale / protéine totale
Définit :Rendement
mesure de l’activité « retenue » après chaque étape de purification en % de l’activité de l’extrait brut
(quantité totale d’activité dans l’extrait initial est admise comme étant 100%)
Taux de purification :
mesure de l’augmentation de la pureté
(activité spécifique à chaque étape / activité spécifique de l’extrait brut)
Quelles sont les 5 mesures de purification d’une protéine?
- Protéine totale
- Activité totale
- Activité spécifique
- Rendement
- Niveau de purification (taux de purification)
Au cours de les différentes étapes de purification, est-ce qu’on s’attend à une augmentation ou une diminution des mesures suivantes?
- Protéine totale
- Activité totale
- Activité spécifique
- Rendement
- Niveau de purification
- Protéine totale ↓ (dim)
- Activité totale ↓ (dim)
- Activité spécifique ↑ (aug)
- Rendement ↓ (dim)
- Niveau de purification ↑ (aug)
C’est quoi un électrophorèse?
Déplacement de molécules chargées dans un champ électrique.
Vitesse de migration dépendante de 6 facteurs :
- Intensité en Volts
- Forme/Poids moléculaire
- Charge de la molécule au pH du milieu
- Température
- Durée de migration
- Concentration en acrylamide (pore size)
Pour le SDS-PAGE, quelle caractèristique va être exploité afin de séparer les protéines?
Taille / poids moléculaire
Pour le PAGE non-dénaturant, quelle caractèristique va être exploité afin de séparer les protéines?
Densité de charge de la molécule
Pour le focalisation isoélectrique, quelle caractèristique va être exploité afin de séparer les protéines?
Charge de la protéine au pH du milieu
Pour l’électrophorèse 2D, quelles caractèristiques va être exploité afin de séparer les protéines? (2)
charge au pH du milieu ET poids moléculaire
Est-ce que les électrophorèses sont toujours sur gel?
non, il en existe sur papier aussi
- Papier flitre
- Acétate de cellulose