Bio Mol II Examen Finale Flashcards
Étapes pour produire des grandes quantités de protéines (5):
1: Synthèse d’une grande quantité d’ADNc
-RT-PCR suivi par l’insert dans une terminaison TA
2: fabrication par génie génétique de vecteurs plasmidiques
3: liaison du vecteur et insert
4: Insertion(transformation) dans le cellule (avec le CaCl2 pour la poration.)
5: production de protéines
Pourquoi on ferait l’insert d’un vecteur dans une cellule non-bactérienne?
L’expression d’un gène eucaryote sera possible dans un système bactérien seulement lorsque le promoteur régulant l’expression est compatible avec tous les éléments de régulation transcriptionnelle bactérienne
Quand est-ce que les gênes comportant l”opéron lac vont être exprimé?
lorsque de lactose ou un analogue du lactose tel que l’isopropylthiogalactoside (IPTG) est ajouté au milieu de culture.
purification des protéines recombinantes:
1: ajouter une courte séquence nucléotidique (étiquette) à l’extrémité de l’ADN insert. La protéine exprimée va avoir six à sept résidus histidine à son extrémité C-terminale (ou N-ter)
2: Lyse de la cellule.
3: Chromatographie avec matrice de chélates de nickel qui va éluer les protéines non-voulues en se fixant aux séquences étiquetées poly-His
4: Libération des protéines en diminuant la pH du colonne
stratégie utilisée pour créer une région cible sur la protéine recombinante par un anticorps donné
L’ajout d’un épitope codant sur l’ADN recombinant
L’insertion de nouveau matériel génétique dans une cellule eucaryotique
Transfection
deux types de transfections
– transfection transitoire (pas d’intégration, donc épisomale)
– transfection stable (intégration habituellement)
- Transfection transitoire :
pas d’integration permenente dans le genome, effets vont finir après 3-4 jours
- Transfection stable
le vecteur introduit s’intègre dans le génome de la cellule hôte, le génome est modifié de façon définitive.
Comment savoir si un transfection est stable?
Un marqueur couramment utilisé est le gène de la néomycine phosphotransférase (néor ) qui confère la résistance à une substance chimique toxique apparentée à la néomycine connue sous le nom de G 418. L’intégration s’effectue de façon aléatoire dans le génome. Par conséquent, on doit effectuer un criblage des clones stablement transfectés
Voies de livraison (infection) (2)
A) virale
- virus à ADN
– cible les cellules quiescentes (moins développé pour la thérapie génétique) - virus à ARN
– utilise les cellules d’empaquetage (méthode de choix pour le transfert de gènes dans les cellules somatiques en croissance)
Voies de livraison (transfection) (6)
B) Non-virale
- chimique
– phosphate de calcium (cellules adhérentes)
– cationique
– liposome - physique
– microinjection (noyau/cytosol)
– balistique (projectile de complexes ADN/métaux)
– électroporation
Liposome vs liposome STEALTH
STEALTH est une voie de transfection spécifique.
but du transfection chimique
ajouter des + à l’ADN(-)
2 étapes d’un création d’un souris KO
– Étape 1 - une construction d’ADN contenant un allèle inactivé d’un gène cible est introduit dans des cellules souches embryonnaires (embryonic stem ES)
Étape 2 – Lors de la création de souris KO, les cellule ES hétérozygotes pour le gène X sont injectées dans des embryons qui sont transférés dans un souris femelle (porteuse).
Les descendants résultant contiennent des tissus dérivés des cellules ES transplantées et des cellules de l’hôte (souris chimères).
Methodes de pertede fonctions (4)
- Perte
– inhibiteurs spécifiques
– protéines recombinantes (DN)
– (KO et CRISPR)
– systèmes suppresseurs d’expression de gène
Methode de gain de fonction (3 sous-methodes)
– expression de protéines recombinantes
* expression exogène (surexpression de la protéine d’intérêt)
* ectopique (dans un environnement inconnu à la protéine)
* endogène (souris mutante, changement du promoteur)
TetR vs operon lac
check notes
Systèmes de suppression de gène (5)
*Antisens (ADNsb)
*Decoy (ADNdb)
*Triple hélice
*ARN interférant (RNAi)
*Ribozyme
avantages(1) et inconvenients(3) de l’antisens (ADNsb) AKA Oligonucléotides anti-sens (ASO)
avantage
*peut traiter avec des mélanges d’oligos ciblant différentes régions
désavantages
*digestion des brins linéaires par exonucléases
*faible taux de livraison
*doit s’apparier avec des régions accessibles
avantages(1) et inconvenients(3) de Thérapie “Decoy” (ADNdb)
avantage :
*peut traiter avec des mélanges
d’oligos ciblant différents FT
désavantages:
*digestion des brins linéaires par
exonucléase
*cible que les FT
*doit s’apparier avec les régions clées
inconvenients(2) de Triple hélice
désavantages
*digestion des brins linéaires par exonucléase
*doit s’apparier avec les régions clées
deux types d’interférence à ARN
- les petits ARN inhibiteurs
(short interfering RNA
“siRNA”) - les microARNs (“miRNA”)
Ribozyme:
ARN avec activité enzymatique (qui clive l’ARNm)
Clivage d’ARN cis vs trans
cis = sur soi même at a different part of the séquence
trans = clivage sur un autre ARN
Northern, Western, Southern
differences
Northern = ARN
Western = Protéines
Southern = ADN
Southern/Northern blot steps (FROM HERE MAYBE READ THE NOTES)
Clivage avec enzymes de restrictions
Electrophorèse
transfert sur un membrane
hybridation avec sonde radioactif
detection
Les blots sont semi quantitatifs, why?
on peut comparer les resultats mais pas savoir les quantités.
western blot, AKA
immunobuvardage
western blot steps
Dénaturation (T haut)
electrophorèse
transfert sur un membrane
marquage avec anticorps + fluorophore
detection avec fluorescence
Micropuce d’ADN
bunch of ADNsb lié covalentement à une micropuce qui detecte l’expression de miliers de gènes
Rouge - expression est > dans les celules traitées à l’ethanol
Jaune - même niveau d’expression
Vert - expression > dans les celules traitées à glucose
Gel à retardement
effectuée pour étudier une interaction entre un acide nucléique et des protéines
should prob find a vid on this.
Gène rapporteur use
utilisé dans le but d’étudier la régulation d’un promoteur cible par des molécules telles que : un facteur de transcription, un coactivateur transcriptionnel, etc.
la luciférase est le gène majoritairement utilisé,
Suite à une lyse cellulaire,
La luciférase en présence de luciférine émet de la lumière à une certaine longueur d’onde. On mesure ainsi par photométrie les niveaux relatifs de luciférase obtenus suite à la transfection du gène rapporteur à luciférase pour les différentes conditions expérimentales.
Gène rapporteur steps
transfection (avec section qui contient luciférase), traitement
lyse cellulaire
emission de photons
