Laboratoire de Biochimie FINAL Flashcards
eq de beer lambert
A = εlc
pI =
valeur de pH ou la charge de l’AA est neutre
utilité du pI à l’électrophorèse
si le pH > pI, le milieu sera basique donc, l’AA ne va pas re-capter son H+ carboxylique donc, il va être chargé (-) et il va migrer vers le borne positif.
si le pH < pI, le milieu sera acide donc, l’AA va capter un H+ supplémentaire sur l’amine donc, il va être chargé (+) et il va migrer vers le borne négatif.
voltage et durée électrophorèse
voltage++ = migration plus vite;
temps de migration++ = migration plus loin;
Acétate de cellulose:
-used to do électrophorèse.
-capable d’absorber le tampon
-capable de conduire la charge
-sépare à la fois les molécules selon leurs charge et leurs tailles
faiblesses du dialyse(2)
-Elle ne permet pas de se débarrasser complètement des molécules non-voulues
et
-Des interactions avec les molécules trop grosses pour sortir peuvent retenir les petites molécules.
Dialyse : Test de Biuret
Détecte la présence de protéines
Le cuivre en solution, normalement bleu, devient violet lorsqu’il interagit avec des acides aminés
Dialyse: Test de Benedict
Détecte la présence de sucres réducteurs
La couleur du précipité dépend de la concentration de sucres réducteurs présents
Extraction d’ARN au phénol-chloroforme: Que-fait le Phénol?
Lyser les cellules, libérer les acides nucléiques des protéines
Extraction d’ARN au phénol-chloroforme: Que-fait le Chloroforme
Solvant organique beaucoup plus dense que l’eau, il permet une belle séparation en phases lors de la centrifugation (le phénol est organique mais a une densité similaire à l’eau)
Extraction d’ARN au phénol-chloroforme: Que-fait l’Isopropanol?
Diminuer la polarité de la phase aqueuse pour faire culoter l’ARN
Extraction d’ARN au phénol-chloroforme: Que-fait l’Éthanol?
ARN n’est pas soluble dans l’éthanol, mais plusieurs contaminants le sont.
pourquoi lors d’une spectro, tu dois prendre l’absorbance de λmax = 260nm avec un grain de sel?
Car, c’est les NUCLÉOTIDES qui absorbent à 260nm, donc l’ARN et l’ADN. donc, plus d’ADN = plus haut absorbance à 260nm. Ceci peut te faire croire que l’ARN n’est pas plus pur, mais plus contaminé avec l’ADN.
quoisse qu’on observe à λmax = 280nm?
phénol et protéines
quoisse qu’on observe à λmax = 230nm?
les saccarides et l’EDTA
pourquoi est-ce qu’on prend la ratio 260/280 et 260/230
si 260/280 > 2 l’ARN est considéré non-contaminé par les protéines et les phénols
et
si 230/280 > 2 l’ARN est considéré non-contaminé par les saccarides et l’EDTA.
(si les deux sont >2, l’ARN est considéré pur._
role du RT
ARNm en ADNc
particularités de l’étape RT
Ne nécessite pas d’amorces: La rétrotranscriptase peut s’attacher à l’ARN sans aide (origine virale)
N’est pas un cycle: Une seule séquence hybridation -> transcription -> fonte est nécessaire
PCR rôle
Amplifier l’ADNg / l’ADNc
RT steps
hybridation (sans amorce)
transcription (d’ADNc)
séparation des brins(fonte)
x1 (Pas un cycle!!!)
combien de cycles dans une PCR
35-40
steps d’un cycle PCR
séparation des brins(fonte) ~95C
amorçage ~60C
transcription ~70C
quelles facteurs affectent la T d’hybridation et pourquoi il est important?
(plus long, plus spécifique ET plus de G et C = plus stable. Ces deux aspects vont faire que notre T d’hybridation augmente la spécifité. Si notre température d’hybridation est trop basse, il y aura une moins spécifité de l’amplicon et donc peut etre lors de l’électrophorèse on aura la présence de plusieurs bandes)
%agarose role
haut pourcentage, traffic jam
bas pourcentage, highway
electrophorèse après le PCR rôle
vérifier la pureté. On pense qu’on a transcrit une sséquence de 210nt, l’électrophorèse montre une seule bande à 210nt (selon l’échelle de poids moléculaires). Notre target est acheived. L’ADN est pur.
CCM role
séparer des composantes d’un composé et les comparer
Test de Molisch:
Pas de coloration - pas de glucides
Coloration rouge violette - glucides présents
Test de l’iode
Coloration rouge - glycogène
Coloration bleue - amidon
Pas de coloration - possibilité de mono ou disaccharides
Test de Barfoed:
Pas ou peu de précipité - sucrose
Précipité rouge-orange abondant en 5 à 8 min.= monosaccharides
Test de Bial:
Pas de réaction – brun opaque - hexose
Coloration bleu foncé (mauve) - pentoses
Test de Seliwanoff:
Pas de réaction - aldose
Coloration rouge - cétose
phase mobile vs phase stationnaire
Phase mobile : solvant polaire qu’on peut alterer pour favoriser une séparation plus efficace.
Phase stationnaire: Gel de silice usually. les substances vont migrer sur celui-ci
Rf equation
distance migré par le substance / distance migré par le solvant(phase mobile)
