Techniques Biochimiques Examen 1 Flashcards
C’est quoi les lectines?
Une classe de protéines qui forment des complexes réversibles avec des mono/oligosaccharides
force de liaison lectine-saccharide __ force de liaison anticorps-antigène
a. >
b. <
c. =
force de liaison lectine-saccharide < force de liaison anticorps-antigène
Beaucoup de lectines végétales ont la capacité d’agglutiner _________
Les érythrocytes (Ou d’autres cellules qui ont à leur surface, de façon accessible, une telle glycoprotéine, glycolipide ou oligosaccharide)
- Un érythrocyte peut avoir jusqu’à 400 000 sites de liaison pour les lectines
Concanavaline A peut se lier au _____ / _____
Mannose / glucose
combien de kDa = ConA
106kDa :)
D’ou provient le ConA
fève haricot sabre/Jack beans
(Canavalia ensiformis)
Combien de sous-unités est-ce que le ConA comporte?
4 sous-unités IDENTIQUES
- 2 sites de liaison de métaux sur le ConA.
-quelles sont ces métaux
-de quelle ordre se lient-ils
- Site1: cation Mn (ou Ni, Co, Zn, Cd, Ca)
- Site2: cation Ca (ou Cd ou Mn)
*une fois Mn lié le Ca pourra se lier
C’est quoi le rôle des sites de liaisons des cations métalliques sur le ConA?
Ils induisent un changement allostérique indispensable pour pouvoir lier les sucres
5 applications/importances biologiques du ConA
- Lie les unités mannose/glucose sur les glycoprotéines (récepteurs ou glycolipides)
- Initier la division cellulaire (lymphocytes T)
- Caractérisation de cellules normales et malignes (ne s’agglutinent pas en présence de la Con A)
- chromatographie d’affinité des glycoprotéines (résine)
- Agent anti-néoplasique (Tumeur) et anti angiogénique (vaisseaux sang.)
à quelle pH est-ce que le ConA sera sous forme tétramérique?
pH : 7.0
à quelle pH est-ce que le ConA sera sous forme dimérique?
pH : 4.5 - 5.5
Quelles sont les risques de la manipulation du ConA?
- Potentiellement allergénique suite à un contact avec la peau ou suite à inhalation
- Irritation sévère aux yeux
Pourquoi est-ce que le ConA reste poingé dans les billes de sephadex G-75
Le séphadex est formé de dextran (bunch o’ glucose)
Les 4 paramètres importants pour une bonne extraction sont :
- La méthode de lyse cellulaire
- Le contrôle du pH
- La température
- Contrôle de la dégradation protéolytique
Parce qu’on ne veut pas dénaturer la protéine.
Quelle est la première étape de la purification d’une protéine?
L’extraction
4 Méthodes d’extraction de protéines douces
- Choc osmotique
- Détergents
- Digestion enzymatique
- Homogénéisateur (de type Dounce)
2 Méthodes d’extraction de protéines modérées
Homogénisation
Moudre avec sable/billes de verre
3 Méthodes d’extraction vigoureuses
- Décompression explosive avec azote
- Moudre avec des billes
- Ultrasonication
Équation de rpm :
Q(rpm) = 299*(RCF/r)^½
Équation de RCF :
RCF = 11,18*r * (Q/1000)^2
Lors d’une centrifugation, c’est quoi une barrière de densité?
C’est la ligne qui sépare une Solvant plus dense à une solvant moins dense.
C’est quoi une centrifugation discontinue vs continue?
Discontinu - on a une ou plusieurs barrières de densités (Densité de l’extrait brut n’est pas = Densité de solvant)
Continu - Aucune barrière de densité (Densité de l’extrait brut = Densité de solvant)
C’est quoi la centrifugation différentielle?
Quand tu centrifuge le lysat d’une cellule (extrait brut) et tu récupère soit le surnageant ou le culot dépendamment où se trouve votre molécule d’intérêt (analyte)
La vitesse de sédimentation est proportionnelle à (3) :
1 - force centrifuge (RCF)
2 - diamètre de la particule
3 - La différence entre la densité du particule et celui du liquide
La vitesse de sédimentation est INVERSEMENT proportionnelle à (1) :
la viscosité du liquide
Quelles sont des facteurs à considerer pour avoir une bonne vitesse de sédimentation
- Densité des particules > Densité du liquide
- Viscosité du liquide faible
Comment utiliser une Nomogramme sur une centrifugeuse?
Basically tu déssine une ligne sur tes valeurs connues et tu va voir ou ça se situe sur l’autre axe.
C’est expliqué à la dernère page (Pg.15) de la présentation nommé “Homogénéisation et centrifugation”
C’est quoi le but d’une dialyse
L’utilisation d’une membrane sémi-perméable pour séparer des solutés par équilibre
C’est quoi le MWCO?
Le poids moléculaire d’un soluté qui ne peut diffuser à travers la membrane à tel point qu’il est retenu à plus de 90%
Quelles facteurs vont causer qu’une particule va se diffuser plus vite (4)?
- Une masse molaire très inférieure au MWCO = diffusion rapide
- Le gradient de concentration
- Osmose
- Le gradient électrique (négligable)
Que va retenir la dialyse?
Les grosses molécules (notamment les protéines)
La concentrations de ____ est diminué durant la dialyse?
Les petites molécules (Notamment les les glucides, les détergents et les sels ex: la sulfate d’ammonium)
Quelle phénomène va faire en sorte que la volume de la sac de dialyse va augmenter après la dialyse?
L’osmose va entrer de l’eau.
(C’est pourquoi on doit s’assurer que notre sac n’est pas plus que 2/3 remplit)
C’est quoi la dialyse en continu?
(on n’a pas fait cette expérience mais c’est good à savoir porbably)
C’est une dialyse plus efficace. Ça emploi une circulation d’eau continu.
Nos molécules indésirables ne vont jamais atteindre l’équilibre de concentration à cause que l’eau est constamment échangé et ça va se diffuser complètement after a while.
La solubilité d’une protéine dans un solvant aqueux dépend de 4 paramètres importants:
‒ Propriétés physiques de la protéine (forme, PM, pI)
‒ Distribution des résidus hydrophiliques/hydrophobiques et des charges en surface
‒ Température et pH de la solution
‒ Composition et concentrations des divers cosolutés
à quelle pH est-ce que la solubilité d’une protéine est minimale?
à un pH qui est égal au pI
5 AA hydrophobes
Phe, Val, Trp, Leu, Ile
C’est quoi “salting in” et “salting out”?
Salting in - augmentation modérée de [ sel ]. Augmentation de la solubilité
Salting out - augmentation intense de [ sel ]. Decrease de la solubilité
Avantages de l’utilisation de la sulfate d’ammonium (6)
- [ (NH4)2SO4 ]↑ = inhibition de croissance microbienne
- Très soluble dans l’eau (jusqu’à 4M)
- facilement centrifugé (faible densité des solutions saturées)
- Chaleur de solubilisation faible (pas de dénaturation des protéines)
- Solution de ce sel légèrement acidique (pH 5.0-6.0)
- les ions NH4 et SO4 favorisent la précipitation protéique (salting out)
{Série de Hofmeister}
C’est quoi le série de Hofmeister
Un schéma de divers ions qui dit si un ion particulier est plus stabilisant(salting out) ou moins stabilisant(salting in).
Pourquoi est-ce que les ions de la série de Hofmeister est dans l’ordre que c’est?
Même 120 ans après la conception, on ne know pas!
C’est quoi la couronne d’eau d’une protéine?
La couche d’eau qui entoure une protéine. Celle-ci est requise pour la bonne fonctionnement de la protéine.
La perturbation de la couronne d’eau à une influence sur la _______ de la protéine.
solubilité
Quelle type de liaison est-ce qu’on va voir entre la couronne d’eau et la protéine?
you guessed it!
pont hydrogènes
L’introduction d’_____ brise les liens couronne-protéine
ions
l’eau est PLUS ordonné autour d’un petit ion, comme le fluorure (il a une grande densité électronique).
L’ion est dite ________ à cause de cette organisation d’eau
cosmotrope
l’eau est DÉSordonné autour d’un grand ion, comme l’iodure (il a une faible densité électronique).
L’ion est dite ________ à cause de cette désorganisation d’eau
chaotrope
Ion cosmotrope = ion ______
stabilisateur ou dénaturant
Ion cosmotrope = ion stabilisateur
Ion chaotrope = ion _____
stabilisateur ou dénaturant
on chaotrope = ion dénaturant
quelle effet est-ce que la denaturation a sur la solubilité des protéines?
ça cause la perte de solubilité des protéines
Trois phénomènes de base agissent pour affecter la solubilité des protéines en solution aqueuse (pour les protéines hydrophile) :
la déshydratation, la neutralisation et la dénaturation
Pourquoi est-ce qu la déshydratation affecte la solubilité des protéines?
En ajoutant des produits déshydratants qui compétitionnent avec les protéines pour l’eau, on peut donc provoquer la précipitation des protéines.
↑hydratation des protéines = ↑solubilité des protéines
Pourquoi est-ce qu la neutralisation affecte la solubilité des protéines?
en amenant le pH proche du pI, on diminue la solubilité
role du précipitation diff.
séparer une protéine d’intérêt d’autres protéines contaminantes
Comment est-ce qu’une chromatographie à affinité nous aide à séparer notre analyte des autres composantes de notre solution?
Il sépare des composés en fonction de leur affinité pour la phase mobile (Pm) vs la phase stationnaire (Ps)
La phase stationnaire est un ligand spécifique à notre analyte.
4 types de chromatographies liquides
Chromatographie:
* d’affinité
* d’exclusion sur gel
* d’échange ionique
* en phase inverse
Comment est-ce que la Chromatographie de filtration sur gel, fonctionne?
Phase stationnaire composée de billes poreuses avec un ouverture de pore déterminée.
Cela sépare le composé en fonction de son taille (Kinda comme un électrophorèse in a way).
De là on peut recolter l’éluant fraction par fraction.
Pour le chromatographie filtration sur gel Comment est-ce qu’on sait quelle fraction contient nos protéines? 🤔
On vérifie l’A280 de chaque fraction pour voir les pics
Le dextran est un polymère de glucose à base d’unités de glucose lié par des liens ____ et ramifié par des liaisons ____
a. (α-1,6)
b. (α-1,3)
4 caractéristiques des protéines qui nous aide à les purifier
- Charge
- Polarité
- Poids Moléculaire
- Spécifité (Anticorps)
Qu’appelle-t-on le processus de rinçage du colonne qui sert à décoller notre molécule d’intérêt de notre phase stationnaire?
l’élution
La chromatographie d’affinité est la méthode de choix pour la purification de protéines ____________ à partir d’un extrait brut
les protéines qui sont peu abondantes
Quelle facteur va déterminer l’efficacité de la chromatographie d’affinité?
L’affinité du ligand attaché à la phase stationnaire avec la protéine ciblée
4 méthodes de dosage de protéines
- Absorption UV de chaînes latérales (280 nm) ou de liens peptidiques (205 nm)
- Liaison d’un chromophore à la protéine (test Bradford)
- Réactions chromogéniques sous conditions alcalines (test Biuret)
- Dot-blotting
Nomme un interférant non-protéique qui a aussi un absorption UV de 280nm:
Hème
Un ratio A280/A260 = ___ indique une quantité négligeable d’acides nucléiques
A280/A260 = 2
Si A280/A260 < 2, on a des A. nucléiques.
deux matériels de cuvettes de mesure d’absorbance:
- Plastique jettable
- Quartz réutilisable
les 2 étapes de la chromatographie d’affinité
- L’adsorption de la molécule d’intérêt/élimination des molécules contaminantes
- La désorption de la molécule d’intérêt. (Élution) en utilisant un agent qui va romper l’intéraction ligand-analyte.
Chromatographie d’affinité sur les ARNm : 2 étapes
- Adsorption sur une résine cellulose couplé à des oligo(dT) à basse force ionique.
- désorption à une grande force ionique.
Pourquoi c’est important de conserver correctement vos protéines purifiés
ça peut conduire à l’inactivation de la protéine
4 facteurs dénaturants qui peuvent mener a la dénaturation des protéines
- Altération des conditions de la solution protéique (pH, température, force ionique)
- Présence de protéases, oxygène ou métaux lourds
- Perte cofacteur essentiel
- Changement des conditions physiques de congélation
Les parametres de stockages de la protéine purifiée dépend (3):
- Caractéristiques de la protéine
- Temps et conditions de stockage
- Éviter conditions de stockage aux points extrêmes de stabilité de la protéine
(pH proche pI, substances dénaturantes)
les protéines sont moins stables à une concentration plus ____
basse
(Donc, garder la concentration protéique à au moins 1 mg/mL)
- Ajouter des additifs au solvant (détergents) en cas de faible concentration protéique
Comment stoquer des protéines pour moins que 24h
- 24h : réfrigérateur à 4 degrés Celsius
Comment stoquer des protéines pour plus de 24h
- Plus de 24h : au réfrigérateur + filtration ou ajout agent antibactérien pour éviter une contamination bactérienne
Comment stoquer des protéines pour plus d’une semaine
- Plus d’une semaine : congélation rapide à l’azote liquide pour éviter la dénaturation et aliquotage + ajout d’agents stabilisateurs (glycérol)
Comment stoquer des protéines pour plusieurs mois
- Plusieurs mois : -20°C + glycérol
Comment stoquer des protéines pour >1 an
- Années : -70°C + glycérol (facultatif)
Deux formes qu’on peut stoquer des protéines
* Stockage à 4°C sous forme _____________________________
ou
*sous forme _________
*sous forme “précipité de sulfate d’ammonium”
ou
*sous forme “lyophilisée”
C’est quoi le lyophilisation?
Déshydratation/Sublimation du solvant à basse température et pression.
De ce fait, notre protéine est réduit en poudre.
4 étapes de la lyophilisation
- Congélation : produit congelé à basse température
- Vide/séchage primaire :protéine est mis dans le lyophilisateur et soumis au vide
- Chaleur/séchage secondaire : chaleur appliquée pour accélérer la sublimation
- Condensation : solvant sous forme vapeur éliminé
4 avantages de la Lyophilisation
- Élimination de l’eau à basse température (séchage agents thermolabiles)
- Stérile
- Poudre obtenue après lyophilisation est facile à resolubiliser
- Produit lyophilisé peut être conservé à des températures douces (réfrigération non requise)
4 inconvénients de la Lyophilisation
- Plusieurs molécules biologiques peuvent être inactivées par le stress associé au séchage à froid
- Oxydation possible du produit à lyophiliser
- Processus long
- Appareillage coûteux
C’est quoi la lyophilisation en anglais
« freeze drying »
Quelles sont les deux buts de la Lyophilisation?
Concentrer les protéines
et
Rendre la protéine facilement stoquable.
Pourquoi est-ce qu’on tourne notre tube à un angle de 45° lors de la congelation à azote liquide?
Pour maximiser le contact entre la solution et l’air.
Qu’est-ce que va arriver si notre protéine n’est pas pure lors de la lyophilisation?
Le lyophilisateur ne va pas éliminer les espèces contaminants qui sont non-volatiles.
De ce fait, ils vont être concentrées aussi!
Donc si notre protéine est sensible à celles-ci à des hautes concentrations, ceci peut dénaturer notre protéine.
(ex:glucide, détergent, sel inorganique)
