Techniken - Elektrophorese Flashcards
1
Q
Agarose-Gel
A
• Agarose: Hauptkomponente des Agars, gewonnen aus Rotalgen • großes, lineares Polysaccharid • aus D-Galaktose und 3,6-Anhydro-LGalaktose, über α-(1→3)- und β-(1→4)- glykosidische Bindungen verknüpft • Auftrennung von DNA, RNA, großen Proteinen (> 500 kDa) • Porengröße abhängig von AgaroseKonzentration 0,5 – 2 % (w/v)
2
Q
Gelelektrophorese: Agarose-Gel
A
• Agarose in Puffer erhitzen --> schmilzt • in Gießschale mit Kamm gießen & erstarren lassen • Kamm entfernen: Löcher = Taschen • in puffergefüllte Laufkammer legen • Probe und Größenstandard auftragen • Elektrophorese starten: Spannung anlegen (laufen von - zu +) • kleine Moleküle wandern schneller als große --> Auftrennung • Sichtbarmachen durch Anfärben (Ethidiumbromid & UV-Licht; Methylenblau)
3
Q
Polyacylamid-Gel
A
• Polymerisation von Acrylamid, quervernetzt durch N,N‘-Methylenbisacrylamid
• Ammoniumperoxosulfat und Tetramethylethylendiamin starten die Polymerisation
• Auftrennung von DNA; mit Zugabe von Natriumdodecylsulfat Auftrennung von Proteinen (SDS-PAGE)
• Porengröße abhängig von Acrylamid-Konzentration 2 – 30 % (w/v)
- unpolymerisiertes Acrylamid ist karzinogen und wird über die Haut aufgenommen!
4
Q
Gelelektrophorese: Polyacylamid-Gel
A
• Glasplatten mit 0,75 – 1,5 mm Abstand einspannen, Kamm einstecken • Acrylamid-Lösung eingießen, polymerisieren lassen • Kamm entfernen: Schlitze = Taschen • in puffergefüllte Laufkammer stellen • Probe und Größenstandard auftragen • Elektrophorese starten • kleine Moleküle wandern schneller als große --> Auftrennung • Sichtbarmachen durch Anfärben (Proteine: Silberfärbung, Coomassie, Amidoschwarz, Fluoreszenz, ...)
