DNA Sequenzierung

Question 1

normale PCR

Answer 1

Matrizen-DNA (template), DNA-Polymerase
\+ Primer, Puffer
\+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP
1. Aufschmelzen (Denaturieren)
2. Primer anlagern (Hybridisieren)
3. Elongation
= 1 Zyklus

Question 2

Sanger-Sequenzierung: vier Ansätze

Answer 2

- Didesoxy-Methode
Reaktionsansatz 1
Matrizen-DNA (template), DNA-Polymerase
\+ Primer, Puffer
\+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP
\+ ddATP
Reaktionsansatz 2
Matrizen-DNA (template), DNA-Polymerase
\+ Primer, Puffer
\+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP
\+ ddCTP
Reaktionsansatz 3
Matrizen-DNA (template), DNA-Polymerase
\+ Primer, Puffer
\+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP
\+ ddGTP
Reaktionsansatz 4
Matrizen-DNA (template), DNA-Polymerase
\+ Primer, Puffer
\+ dATP, dCTP, dGTP, dTTP
\+ ddTTP

Question 3

Sanger-Sequenzierung: Automatisierung

Answer 3

• Matrizen-DNA (template), DNA-Polymerase
  + Primer, Puffer
  + dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  + ddNTPs an Fluorochrome gekoppelt: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP
• Mischung wird auf einem Kapillargel aufgetrennt
  Laser tastet durchlaufende Fluorochrome ab
  Signalanalyse am Computer

Question 4

Next Generation Sequencing

Answer 4

• Hochdurchsatzverfahren, Sequenzierung ganzer Genome unterschiedliche zugrunde liegende Verfahren
  • Fragmentierung des Genoms
  • parallele Analyse der Fragmente
  • Zusammensetzung der Sequenz aufgrund
  überlappender Enden im Computer
  • stark automatisiert
  Probleme:
  • geringere Genauigkeit als Sanger–>mehrfaches Lesen
  • (noch) teuer: Gerät, Rechenleistung, Speicherkapazität
  • Schwierigkeiten bei hochrepetetiven Sequenzen
  • keine Analyse epigentischer Modifikationen

Question 5

Third Generation Sequencing

Answer 5

• will Probleme der NGS umgehen
• Sequenzierung auf der Ebene eines Moleküls, d.h. der DNA einer Zelle
  –> keine PCR mehr!
  Beispieltechniken z.Z. in der Entwicklung:
• Nanoporen-Sequenzierung
• Single molecule real time sequencing