DNA modifizierende Enzyme Flashcards
Arten der Krümmung
- gebogen (curved) aufgrund der Basensequenz - verbogen (bent) aufgrund der Bindung an Proteine - verdreht (twist) aufgrund der Torsionsspannung
Propeller twist
viele Basenpaare sind nicht perfekt coplanar,
sondern wie Propellerblätter gegeneinander verdreht
–> Verstärkung der Stapelwechselwirkung
Roll: Basenstapel öffnen sich,
positiv wenn Öffnung zur kleinen
Furche zeigt, + 20° bis – 10°
Slide: positiv, wenn oberes
Basenpaar mehr nach links geht,
+ 3 Å bis – 1 Å
Twist: positiv, wenn oberes Basenpaar von oben gesehen gegen Uhrzeigersinn dreht, \+ 20° bis + 50°, meist +34 ° ABBILDUNG
k
= Krümmung
- nach oben/unten
t
= Drehung
- nach rechts (+)
- nach links (-)
ABBILDUNG
Binden von Proteinen an DNA allgemein
1) Anlegen (docking): passen DNA und Protein in großem Maßstab zusammen?
ist die DNA an dieser Stelle flexibel genug und/oder in die richtige Richtung gebogen?
2) Prüfen (probing): können sich zwischen bestimmten Basen und Aminosäuren
Wasserstoffbrückenbindungen an der Kontaktzone ausbilden?
=> sequenzspezifische Protein-DNA-Bindung
- Proteine verbiegen die DNA: Beispiel 434-Repressor
Supercoil in zirkulärer DNA
- entspannte zirkuläre DNA
= eine Kreuzung der Stränge auf 10 bp - überspiralisierte zirkuläre DNA
= mehr als 1 Kreuzung auf 10 bp: positiv überspiralisiert = überdreht
weniger als 1 Kreuzung auf 10 bp: negativ überspiralisiert = unterdreht - toroidal (coil) –> verdreht (supercoil)
ABBILDUNG
Supercoil in linearer DNA
Unterteilung der DNA in mehrere Schlaufen
durch Bindung an Grundgerüst
typisch für eukaryotische Chromosomen
ABBILDUNG
Linking number
= Verwindungszahl
twisting number + writhing number
Tw twisting number (Drehungszahl): wie oft dreht sich das Molekül?
Wr writhing number (Überkreuzungszahl): wie oft kreuzt es sich mit sich selbst?
ABBILDUNG
Topoisomerasen
• B-DNA hat eine Windung pro 10 bp
• menschliches Chromosom 1 hat 250 Mbp
–> zur vollständigen Replikation 25 Millionen Umdrehungen der chromosomalen DNA erforderlich!
semikonservative Replikation bei zirkulärer DNA unmöglich?
Lösung durch Topoisomerasen:
entwinden die DNA nicht, sondern verhindern Überspiralisierung!
Helix öffnet sich wie ein Reißverschluss, ohne dass sich das Molekül drehen muss
Typ-I-Topoisomerasen
• erzeugen einen Einzelstrangbruch
• ein Ende des Strangs bleibt kovalent ans Enzym gebunden
• das andere Ende wird bewegt und durch die Lücke gezogen
• Einzelstrangbruch wird wieder geschlossen
=> L linking number (Verwindungszahl) wird um 1 reduziert
Beispiele:
- Topoisomerase I und II von E. coli
- Topoisomerase III bei Hefe und Mensch
- Topoisomerase I der Eukaryoten
Catenan
= verkettete DNA, zwei oder mehr ringförmige DNA-Moleküle, die wie die Glieder einer Kette ineinandergreifen
Typ-II-Topoisomerasen
= trennen Catenan auf
1. Typ-II-Topoisomerase bindet kovalent an beide Stränge des grünen Chromosoms
2. Topoisomerase-“Tor“ öffnet sich, rotes Chromosom geht hindurch
3. “Tor“ schließt sich
4. Lösen der kovalenten Bindung
=> L= linking number (Verwindungszahl) wird um 2 reduziert
kovalente Bindung
= Atombindung, Elektronenpaarbindung oder homöopolare Bindung
- 2 Atome haben gemeinsames bindendes Elektronenpaar (teilen sich Elektron in Außenschale & werden so zusammengehalten)
Helikase
= ringförmige Hexamere
• trennen die Wasserstoffbrücken zwischen den Einzelsträngen = „Aufschmelzen“ der DNA
• ssDNA in der Mitte durchgefädelt, Untereinheiten ziehen ssDNA durch unter ATP-Hydrolyse
• jede Untereinheit durchläuft dabei den Zyklus
ATP-gebunden – ADP-gebunden – leer – ATP-gebunden – usw.
ABBILDUNG
Nukleasen
= sind eine Gruppe von Enzymen, deren hauptsächliche Funktion im partiellen oder vollständigen Abbau von Nukleinsäuren besteht. Man spricht auch vom partiellen oder vollständigen Verdau eines Substrates.
Exonukleasen
= spalten DNA/RNA endständig
–> einzelnes Nukleotid + kürzeres Nukleinsäure- Molekül entsteht
Endonukleasen
= spalten in DNA/RNA eine innere Phosphodiesterbindung –> zwei Fragmente entstehen
• z.B. Homing-Endonucleasen: Erkennungssequenz asymmetrisch, oft 20-30 bp lang, kommen in mobilen genetischen Elementen (z.B. selbstspleißenden Introns) vor, werden in 6 Gruppen eingeteilt
• z.B. Restriktions-Endonukleasen („molekulare Scheren“):
• Typ I – schneiden an einer zufälligen Stelle weit von der Erkennungssequenz entfernt, bisher < 40 charakterisiert
• Typ II – schneiden in der meist palindromischen und 4/6/8 bp langen Erkennungssequenz oder in unmittelbarer
Nähe, bisher > 2800 charakterisiert
• Typ III –schneiden 20-35 bp von der Erkennungssequenz entfernt, bisher < 10 charakterisiert
• Typ IV – schneiden nur methylierte DNA
• Typ V – benutzen Führungs-RNA, z.B. in CRISPR
Restriktion
in Bakterien schützt Methylierung die eigenen DNA vor Hydrolyse durch eigene Endonukleasen
Fremd-DNA (z.B. von Phagen) ist nicht methyliert und wird zerschnitten
Phagen bleiben auf ihren Stamm beschränkt; Beschränkung = Restriktion
Nukleasen: Beispiel EcoRI
- aus Eschericha coli Stamm R, Nuklease Nummer I (eins)
- Homodimer
- schneidet dsDNA
- palindromische Erkennungssequenz 5’-GAATTC-3
- erzeugt Fragmente mit 5‘-Überhang: klebrige Enden (sticky ends
Nukleasen: Beispiel SmaI
- aus Serratia marcescens, Nuklease Nummer I (eins)
- schneidet dsDNA
- palindromische Erkennungssequenz 5’-CCCGGG-3
- erzeugt Fragmente ohne Überhang: stumpfe Enden (blunt ends)
DNA-Methyltransferasen = Methylasen
• keine Mutation, sondern eine Modifikation
• sequenzspezifisch je nach Methylase
• an A oder C
• Methylasen sind spezies-spezifisch
• wichtigste epigenetische Veränderung, bleibt bei DNA-Replikation erhalten
• Regulation der Genexpression, Schutz vor Restriktionsenzymen
ABBILDUNG
Ligasen
= Schließen Einzelstrangbrüche (nicks)
ABBILDUNG
Zusammenfassung
- DNA-Helix ist gebogen aufgrund der Basensequenz, verbogen aufgrund der
Bindung an Proteine, verdreht aufgrund der Torsionsspannung - DNA-Helix ist flexibel: roll, slide, twist ermöglichen Krümmung k und Drehung t
- Supercoil speichert Dreh-Energie DNA verhält sich anders
- für ringförmige DNA-Moleküle: Drehungszahl Tw und Windungszahl Wr
- natürlich vorkommende DNA ist unterspiralisiert
- Topoisomareasen verhindern Überspiralisierung (Typ I, Typ II)
- Helikasen trennen die Wasserstoffbrücken zwischen zwei DNA-Molekülen
- Nukleasen schneiden die Doppelhelix (molekulare Scheren: Restriktionsenzyme)
- Methyltransferasen markieren A oder C sequenzspezifisch mit Methylrest
- Ligasen schließen Einzelstrangbrüche
