Techniken - Blots Flashcards
1
Q
Blots
A
- Southern Blot, Northern Blot:
Detektion bestimmter Nukleinsäurefragmente
Probe: Gemisch von Nukleinsäurefragmenten
Sonde: einzelsträngige DNA oder RNA, komplementär zur Sequenz des gesuchten Fragments - Western Blot:
Detektion von Proteinen
Probe: Proteinmischung
Sonde: Antikörper, diese binden nur an das gesuchte Protein
2
Q
Southern Blot für DNA
A
- 1975
• DNA ggf. in Stücke schneiden
• Gemisch mit Gel auftrennen (Agarose, Acrylamid)
• denaturieren: DNA wird einzelsträngig
• blotten: DNA auf Membran übertragen
(Kapillarblot, Elektroblot)
• blocken: Sonde kann nur an DNA binden,
nicht an Membran ( unspezifische Bindestellen maskieren)
• hybridisieren: Sonde = markierte ssDNA
(radioaktiv, DIG, Biotin/Streptavidin)
• waschen: ungebundene Sonden entfernen
• Detektion: mit Röntgenfilm oder Licht-/Farbreaktion
ABBILDUNG
3
Q
Northern Blot für RNA
A
- 1977 James Alwin, James Kemp, George Stark
• Probe: z.B. alle mRNA einer Zelle
• Gemisch mit Gel auftrennen (denaturierende Gele)
• blotten: RNA auf Membran übertragen (Kapillarblot, Elektroblot)
• blocken: Sonde kann nur an RNA binden, nicht an Membran
• hybridisieren: Sonde = markierte ssDNA oder ssRNA
(meist radioaktiv)
• waschen: ungebundene Sonden entfernen
• Detektion: mit Röntgenfilm oder Licht-/Farbreaktion
4
Q
Western Blot für Proteine
A
- 1979 Robert Nowinski, W. Neal Burnette, Harry Towbin
• Probe: z.B. alle Proteine einer Zelle
• Gemisch mit Gel auftrennen (SDS-PAGE)
• blotten: Proteine auf Membran übertragen
(Kapillarblot, Elektroblot)
• blocken: Sonde kann nur an gesuchtes Protein binden, nicht an Membran
• Immundetektion: Sonde = markierte, spezifische
Antikörper (radioaktiv oder enzymatisch)
• waschen: ungebundene Antikörper entfernen
• Detektion: mit Röntgenfilm oder Licht-/Farbrektion
5
Q
Übersicht
A
- Southern: DNA & ssDNA
- Northern: mRNA, ssDNA oder ssRNA
- Western: Protein & Antikörper
