Sequencage 1 Flashcards
La méthode de Sanger ?
1977
Méthode de terminaison de la polymérisation par inhibition (méthode enzymatique)
Qu’est-ce que le séquençage de ADN ?
C’est la détermination de la succession des nucléotides le composant
Qu’utilise la méthode du séquençage de l’ADN ?
Utilise les connaissances qui ont été acquises depuis une trentaine d’année sur les mécanismes de latéralisation de ADN
Aujoud’hui c’est une technique de routine pour les laboratoires de biologie
Principe de la PCR ?
$ d’un brin d’ADN par une ADN polymérase mais avec quelques différences avec de séquençage de Sanger :
- 1 seule amorce (contre 2 pour la PCR)
- des nucléotides ≠ sont ajoutés en faible quantité : les didésoxyribonucléotides (ddNTP) en + des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP)
≠ entre les ddNTP et les dNTP ?
Diffèrent par l’absence d’un groupement OH en position 3’
→ ainsi lorsqu’une ADN Pol utilise un ddNTP, elle n’est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à sa suite → la $ du brin d’ADN s’arrête
Protocole du séquençage de ADN ?
Il faut préparer un mélange contenant :
- Le fragment qui doit être séquencé
- 1 seule amorce radioactive d’ADN de 15 à 25 nucléotides, complémentaire d’une séquence d’ADN connue, située juste en amont de l’ADN à séquencer
- les 4 dNTP (dCTP, dATP, dGTP, dTTP)
- 1 ADN Pol
- 1 seul ddNTP ( ddATP ou ddTTP ou ddGTP ou ddCTP) par tube → son incorporation stoppe la polymérisation
Grace à quoi se fait la détection des fragments $ ?
Se fait grâce à l’amorce radioactive
Séparation des produits de séquençage en fonction de quoi ?
De la taille
Combien de produit final de séquençage dans le cas avec ddATP ?
10 produits de séquençage finissant par in ddA dans le tube
Combien de produits finaux dans le cas avec le ddGTP ?
7 produits de séquençage finissant par un ddG dans le tube
Combien de produits finaux dans le séquençage avec le cas du ddCTP ?
9 produits de séquençage finissant par un ddC dans le tube
Combien de produits finaux dans le séquençage avec le cas du ddTTP ?
10 produits de séquençage finissant par un ddT dans le tube
Électrophorese sur gel d’acrylamide ?
- D’élection des fragments d’ADN, en exposant un film autoradiographique au gel selon le marquage du dNTP
- suivant la taille des gels la séquençage lue est limitée de 200 à 750 nucléotides environ
Comment se lie le séquençage sur gel d’acrylamide et’électrophorèse ?
Se lit du bas vers le haut et on a la sq complémentaire
→ technique contraignante en radioactivité
Pourquoi quand l’amorce est radioactive, on doit faire les 4 réactions de
séquence dans des tubes différents et les faire migrer dans des puits différents ?
Les fragments produits par la réaction de séquence seront tous marqués avec de la
radioactivité, donc si électrophorèse dans un seul puit, impossible de distinguer les
fragments venant des 4 réactions de séquence
Comment se fait la réaction avec les 4 ddNTP ?
La réaction se fait dans un même tube, chaque ddNTP est marqué par un fluorochrome ou fluorophore puis la séparation des produits de la réaction de séquence se fait par chromatographie
Avec quoi les 4 réactions avec les ddNTP se font ?
- ddGTP + ddATP + ddCTP + les 4 dNTP
-le fragment d’ADN qui doit être séquencé - une seule amorce d’ADN de 15 à 25 nuclédidos, complémentaires d’une séquence d’ADN connue, située juste en amont de l’ADN à séquencer
- ADN Pol
De quoi sont capables les séquenceurs automatiques ?
Sont capables de réaliser les réactions de séquençage puis de la lire
Une fois la réaction de séquençage terminée, la taille des fragments est déterminé par quoi ?
La taille des fragments obtenus est déterminée par chromatographie
Que détecte le séquenceur dans les colonnes de chromatographie ?
Le séquenceur détecte la fluorescence sortant des colonnes de chromatographie, repérant ainsi les fragments d’ADN, LEM taille et le dernier ddNTP fluorescents en 3’.
Que permettent de lire les séquenceurs ?
Les séquenceurs permettent de lire pls centaines de nucléotides avec une thés bonne qualité jusqu’à 1 000 pour les appareils les plus performants
À quoi correspond la séquence lue sur le gel lors du séquençage de l’ADN par la technique de Sanger ?
La séquence lue sur le gel correspond à la séquence du brin $ durant la réaction de séquençage et elle est complémentaire du brin à séquencer
