PCR 2 Flashcards
De quoi font parties les amorces pendant la PCR ?
Font parties du produit de PCR = ADN amplifié = amplicon
Programme PCR ?
25-35 cycles
Durée moyenne : 1-3H
PCR permet de copier quoi ?
Permet de copier en segment ADN des millions de fois grâce à un appareil qui contrôle les changements de T à différentes étapes de la réaction
= thermocycleur
Thermocycleur ?
Appareil automatisant la réaction de PCR
Quelles types de T gère le thermocycleur ?
- T de dénaturation
- T d’hybridation
- T d’élongation / polymérisation
De quoi est composé le thermocycleur ?
Muni d’un bloc thermique (thermal Peltier block) avec des puits (trous), où l’on peut insérer les tubes contenant le mélange réactionnel de la PCR
Comment varie la T dans le thermmocycleur ?
Peut varier très rapidement et précisément entre 4-100°C
Que permet d’obtenir la PCR ?
Permet d’obtenir à partir d’un échantillon complexe et peu abordant, d’importantes quantités d’un fragment d’ADN spécifique et de longueur définie
Comment se fait l’amplification de la PCR en théorie ?
Se fait de manière exponentielle 2^n et du bout de 20 cycles, il devrait y avoir un million de copies de la cible à partir d’une molécule ADN
Si rendement 100% → Nf = No x 2^n = 1 x 2^20 = 1 048 576 copies
Rendement réel de la PCR ?
En réalité, le rendement n’est pas aussi élevé (1 048 576 copies), il diminue d’ailleurs fortement quand la cible comporte + de 1000 pb
Si rendement 90% → Nf = No x 2^n = 1 x 1,9^20 = 375 899 copie
Qu’est-ce qu’on finit par atteindre avec la PCR ?
On atteint un plateau car la Taq Pol perd son activité ou épuisement des réactifs, par exemple.
Qu’est-ce qui est visualisés sur le gène d’agarose par électrophorèse ?
Les fragments ADN
Qu’est-ce que l’amplicon dans le gel d’agarose ?
Produit PCR
Les a nucléiques perdant l’électrophorèse ?
Sont rendus fluorescents grâce à un colorant qui se fixe sur l’ADN ; bromure d’ethidium, SybrSafe… et analyse sous la lampe UV
Liste non exhaustive des applications de la PCR ?
- Dépistage des maladies génétiques
- dépistage d’infections bactériennes
- dépistage d’infections virales
→ détection présence virus
→ dosage de la qtt de virus par RT-PCR quantitative
Exemple mucoviscidose ?
- Mucus + viscosité
- maladie génétique récessive
- en France, elle touche en moy 1 personne sur 34 hétérozygotes
- 1ère maladie génétique en France métropolitaine, plus de 2 millions de personnes sont porteuses saines d’un allèle du gène de la mucoviscidose
- 1 naissance sur 4 500, soit ~ 200 à 250 nv cas/an
- 7 000 pers sont atteintes en France
Symptôme mucoviscidose ?
Au nv pulmonaire, l’épaississement du mucus encombre los bronches et entraine en premier lieu une toux chronique, ainsi qu’une gène et une diminution de la fonction respiratoire
À quoi conduit les symptômes de la mucoviscidose ?
Conduit progressivement à une bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) puis à terme, une insuffisance respiratoire.
L’encombrement des bronches fait également le lit d’infections bactériennes fréquentes difficiles à traiter
Le plan digestif de la mucoviscidose ?
Sur le plan digestif, l’hyperviscosité des sécrétions pancréatiques ne permet pas aux enzymes qu’elles contiennent d’être déversées dans l’intestin
De quoi souffrent les patients atteints de mucoviscidose ?
Souffrent d’une malabsorption des graisses, et parfois des nutriments et dos vitamines
Quel est le gène impliqué ds la mucoviscidose ? Position, taille, constitution, code pour ?
Le gène CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
Il est situé sur le K 7
Il fait 250 Kb en taille.
Constitué de 27 exons et code pour une prot de 1480 aa
Rôle de la prot CFTR dans la mucoviscidose ? Sa fonction ?
Joue le rôle de canal ionique à chlore.
Sa fonction normal est de réguler le transport des ions chlorures à travers la membrane cellulaire
Comment est le gène CFTR dans la mucoviscidose ?
Il est muté, rendant cette protéine soit anormale, soit absente.
Conséquences (chlore) du gène CFTR muté dans la mucoviscidose ?
Le chlore ne circule plus correctement à travers la paroi cellulaire,
entraînant des déséquilibres importants
Conséquences (fluides corporelles) du gène CFTR muté dans la mucoviscidose ?
Les fluides corporels n’ont notamment plus assez d’eau, engendrant une augmentaion
de leur viscosité, une mauvaise évacuation et une inflammation locale
Combien de mutation de la mucoviscidose connue à ce jour ?
2 000
Quelle est la mutation de la mucoviscidose la plus fréquente ?
La mutation deltaF508.
Elle représente 80% des mutations.
Elle est située dans l’exon 10
- Notation WT.F508 = allèle qui ne contient pas la délétion deltaF508 (ADN : TAG AAA CCA)
- Notation deltaF508 = allèle ayant une délétion de 3 nucléotide (ADN : TAA CCA = G AA ont disparu) → pas de changement du cadre de lecture (délétion de la phénylalanine)
comment savoir si l’enfant aura la mucoviscidose ?
faire amniocentèse → extraction d’ADN du fœtus
Qu’est-ce que le Streptocoque B ?
C’est une bactérie que l’on retrouve dans le vagin de façon naturelle chez 10-30% des femmes → porteuses saines, sans symptômes
Que peut faire une femme porteuse saines du Streptocoque B ?
peut infecter son enfant au cours de l’accouchement.
Chez l’enfant, peut avoir des conséquences graves : septicémie, pneumonie, méningite…etc
