PCR 3 Flashcards
dépistage streptocoque B chez femmes enceintes ?
prélèvement vaginal dans les dernier mois de grossesse.
Réalisé par PCR en cherchant à amplifier une partie de l’ADN de la bactérie recherchée dans le prélèvement vaginal (approche ciblée → PCR utilisant amorces spécifiques d’un fragment d’ADN de la bactérie recherchée)
détection de la présence d’un virus (ex : VIH) ?
PCR sur ADN nucléaire de lymphocytes
que représente la charge virale ?
la quantité d’ARN du virus
comment fait on le dosage de la quantité
de virus ?
Par RT-PCR.
On ne peut pas amplifier l’ARN par PCR donc il faut passer par une copie ADN de l’ARN
Étape du dosage de la quantité d’un virus par RT-PCR ?
1) extraction d’ARN à partir du sang
2) reverse transcription (RT) in vitro → obtention d’une copie d’ADN de l’ARN appelée ADN complémentaire (ADNc)
3) PCR quantitative (qPCR) sur l’ADNc viral
ARN viral →(RT)→ ADNc viral → PCR quant.
comment se trouve l’ARN viral ?
l’ARN viral se trouve avec plusieurs milliers d’ARN cellulaires ≠ (viennent de l’expression de pls milliers de gènes différents)
comment fait on la Reverse Transciptase de l’ARN viral ?
Reverse Transcriptase uniquement de l’ADN viral en utilisant une amorce spécifique du brin d’ARN viral
→ la transcriptase inverse est une ADN pol ARN-dépendante
qu’obtiens-t-on à la $ du 1er brin d’ADNc viral ?
un hybride ARN viral / ADNc viral
par quoi est dégradé l’ARN viral ?
par RNase H qui dégrade l’ARN hybridé avec l’ADN
ou
par de la soude = NaOH : action sur ARN (ribose)
que se passe-t-on lorsqu’on a obtenu le 1er brin d’ADNc viral = ADNc simple brin ?
$ du deuxième grâce à la mise en place d’une amorce spécifique du 1er brin ADNc viral (5’P → 3’OH)
que se passe-t-il lorsqu’on a obtenue ADNc viral double brin ?
action de l’ADN pol ADN dépendante + dNTP + tampon (pour finir $ double brin)
puis on peut réaliser la PCR quantitative sur ADNc viral (RT-PCR quantitative)
principe de l’estimation de la charge virale par PCR quantitative ?
→ la quantité d’ADNc viral est proportionnelle à la quantité d’ARN viral dans le sang
= proportionnalité entre la quantité initiale d’ARN viral et la quantité de produit de RT-PCR
principe de la PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel ?
incorporation d’un signal fluorescent (agent intercalent fluorescent, ex : SYBR green) aux molécules d’ADN double brin pour suivre leur formation au cours de la PCR
→ permet de suivre l’amplification de l’ADN en temps réel
étapes de la qPCR ?
1) SYBR green peu fluorescent si libre
2) SYBR green n’inhibe pas la réaction de PCR
→ élongation et insertion du SYBR green
3) fin de étape élongation
4) la lumière émise est proportionnelle à la quantité d’ADN double brin
qu’est-ce que le fluorochrome ou fluorophore ?
substance chimique capable d’émettre de la lumière de fluorescence après excitation
qu’es-ce que le Ct dans la qPCR ?
= cycle seuil (cycle threshold) est le nombre de cycles d’amplifications nécessaires afin d’atteindre une valeur seuil d’évaluation de la fluorescence
→ la valeur Ct est inversement proportionnelle à la quantité d’ADN initiale
objectif de la qPCR ?
doser la quantité d’ADNc viral d’un échantillon ou comparer la quantité d’ADNc viral entre pls échantillon ≠
quantité ADNc initiale et Ct ?
plus la quantité d’ADNc initial est élevée, plus la valeur de Ct est faible
→ un différence de 1 Ct correspond à un facteur 2 en quantité d’ADN
(considéré comme (-) pour le SARS-Cov2 quand Ct > à 35
