PCR 1 Flashcards
Que nécessite au minimum le mécanisme de la réplication in vivo de l’ADN ?
- La séparation des deux brins d’ADN à répliquer ( activité hélicase)
- une amorce ARN nécessaire pour initier la réplication ( rôle de la primase)
- une ADN Pol ADN-dépendante qui $ le brin complémentaire à partir d’un brin matrice en utilisant les désoxyribonucléotides C, G, A, T (dNTP)
Del PCR ?
( Polymerase chain reaction)
C’est une technique de biologie moléculaire mise au point en1985 par Karry Mullis (prix Nobel en 1993)
Technique de la PCR ?
Technique de réplication in vitro de l’ADN
Que permet la PCR ?
Permet d’obtenir, à partir d’un échantillon peu abondant, d’importantes quantités d’un fragments précis d’ADN double brin et de longues définie.
Permet d’obtenir plusieurs millions de copies en quelques H
Application de la PCR en médecine ?
- Dépistage maladies génétiques
- dépistage infection bactérienne
- dépistage d’infection virales ( VIH, Sars-cov2 ( Covid)
Application PCR justice ?
- Identification d’individu par empreinte génétique
- détermination de la filiation
Application de la PCR en paléogénétique ?
- L’étude sq ADN ancien permettant de comparer matériels génétiques d’espèces différentes, donc établir leur relation phylogénétique et d’apprécier les variations génétiques entre les individus d’une même espèce (PCR et séquençage)
Application PCR en industrie agroalimentaire ?
- Production de plantes transgéniques avec des résistances à des pathogènes comme le maïs BT. (PCR utilisée dans le clonage moléculaire)
Application PCR en industrie pharmaceutique ?
- Production d’insuline dans des bactéries génétiquement modifiées (PCR utilisée dans le clonage moléculaire)
Principe de la PCR ?
Il s’agit de réaliser une succession de réactions de réplication d’une matrice double brin d’ADN
Que met en œuvre chaque réaction de la PCR ?
Met on œuvre deux amorces ADN (oligonicléotides) dont les extrémités 3’OH pointent l’une vers l’autre
Que définissent les amorces (primers) ?
Def les extrémités de la sq à amplifier
Idée de la PCR ?
Répéter les cycles de réplication → ce qui double la quantité après chaque cycle
Astuce PCR ?
Utiliser les produits de chaque étape de $ comme matrice pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale
Amplification de la PCR ?
Non linéaire mais exponentielle 2
Composants de la réaction PCR ?
Sont introduits dans le même tube :
- la matrice ADN db à amplifier
- 2 amorces (18 bases) simples brinsspécifiques de ADN à amplifier
- 4 désoxyribonucléotides (dNTP) → G, C, T,
A
- 1 ADN Pol (taq Pol)
Comment est la taq Pol ?
- Avec Mg2+
- isolée à partir de la bactérie thermophile Thermus aquaticus, elle est thermostable
Comment sont fabriquées les amorces ADN pour une réaction PCR ?
Les amorces ADN avec des sq nucléotidiques précises et sont fabriquées par dos machines appelées synthétiseurs
Comment doivent être les sq des amorces pour la PCR ?
Doivent être définies et $ en respectant le sens 5’P → 3’OH
Ces amorces sont simples brin, et donc prêtes à s’apparier avec les brins d’ADN matrices qui leur sont complémentaires
Activation, isolation, demi-vie, produite par pour la taq polymérase ( ADN Pol ADN dépendante thermorésistante) ?
- Active à des T élevées (T optimale = 68 à 72°C)
- isolé à partir de la bactérie thermophile thermus aquaticus
- demi-vie à 95°C est ~ 30 à 40min
- est produite par génie génétique dans E. Colis
Polymérisation, activité, existante de certain ADN chez la taq polymérase ( ADN Pol ADN dépendante thermorésistante) ?
- Elle polymérise ~ 400 bases en moins de 20s
- elle n’a pas d’activité 3’-5’ exonucléases → pas de correction sur épreuve → 1 erreur tous les 9000 nucléotides
- il existe des ADN Pol haute fidélité qui ont des activités correctrices
À quoi est liée la correction sur épreuve ?
Liée à une activité exodésoxyribónucléase 3’ → 5’ de ADN Pol
Élimination de quoi perdant la correction sur épreuve ?
Élimination du nucléotide non apparié par une activité exodesoxyribonucléase 3’ → 5’ de ADN Pol
Étape de la PCR ?
1) Dénaturation
2) hybridation des amorces
3) élongation/polymérisation
Étape de dénaturation de la PCR ?
- T =95°C
- étape de dénaturation permet de séparer les 2 brins ADN à amplifier (rôle de l’hélicase dans la réplication in vivo)
- la chaleur détruit les liaisons H
T de hybridation ?
- Devra être calculée pour chaque nv PCR
- hybridation se fait à une T qui sera def selon la nature des amorces
- lette T va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces matrice est réalisé
- la T est fixée entre 55 et 65°C en fonction de la sq des amorces et elle est basée sur la Tm : ( Tm =2(A + T) + 4(G + C))
Que permet l’étape d’hybridation de la PCR ?
Permet d’hybrider les amorces aux 2 brins d’ ADN et la fixation de ADN Pol sur l’extrémité 3’OH libre des amorces
T de l’étape d’élongation/polymérisation de la PCR ?
Est à 72°C → T de “travail” de ADN poly thermorésistante utilisée.
Au cours de cette étape, les brins complémentaires d’ADN sont $ à partir des extrémités 3’OH libre des amorces hybridées
Que $ ADN Pol pdt l’étape d’élongation de la PCR ?
$ ADN complémentaire du brin matrice
→ à la fin, on a double la quantité ADN/dupliqué le double brin matrice
L’amplicon ?
= région ADN ciblée par les 2 amorces
→ fragment ADN correspondant précisément à la région à amplifier qui contient les 2 amorces
